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利用滑动窗口和KNN算法识别差异甲基化区域

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杭州电子科技大学学报（自然科学版） 2016年第4期36卷 35-39页

作者：李华兵杨昆杭州电子科技大学计算学院浙江杭州310018

针对现有差异甲基化区域DMRs识别方法中过度删除显著性弱的甲基化位点、DMRs长度受限以及不能直接处理多类的问题,提出了一种利用滑动窗口和KNN算法识别不同类别间DMRs的算法.算法先通过滑动窗口结合KNN分类器筛选候选区域,再根据误差... 详细信息

针对现有差异甲基化区域DMRs识别方法中过度删除显著性弱的甲基化位点、DMRs长度受限以及不能直接处理多类的问题,提出了一种利用滑动窗口和KNN算法识别不同类别间DMRs的算法.算法先通过滑动窗口结合KNN分类器筛选候选区域,再根据误差率合并候选区域得到DMRs.真实数据上的实验表明,算法的分类性能、聚类指数明显优于对照算法,扩展了对照的Ong算法识别的DMRs长度,并能发现Ong算法未发现的DMRs.

关键词：差异甲基化区域滑动窗口 KNN分类器多类问题聚类指数

鸡早期性腺发育相关DNA甲基化区域的鉴定及其对基因表达的调控分析

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鸡早期性腺发育相关DNA甲基化区域的鉴定及其对基因表达的调控分析

作者：陈立根华中农业大学

学位级别：硕士

DNA甲基化在鱼类、哺乳动物等脊椎动物的性别决定与性分化中起着关键作用。但在鸡性腺发育中DNA甲基化的研究极少,且大部分研究集中于雄性高甲基化区域（malehypermethylated,MHM）。目前还未有在鸡早期性腺进行全基因组DNA甲基化的分析... 详细信息

DNA甲基化在鱼类、哺乳动物等脊椎动物的性别决定与性分化中起着关键作用。但在鸡性腺发育中DNA甲基化的研究极少,且大部分研究集中于雄性高甲基化区域（malehypermethylated,MHM）。目前还未有在鸡早期性腺进行全基因组DNA甲基化的分析,尚不清楚是否存在性腺组织特异性差异甲基化区域（differentially methylated region,DMR）对性别决定与性分化有调控作用。因此本研究选取胚胎期6天和10天的鸡性腺组织,采用全基因组亚硫酸盐测序（whole-genome bisulfite sequencing,WGBS）和转录组测序（RNA-seq）相结合的方法,探讨DNA甲基化对性腺发育相关基因的性别差异表达的调控关系,并重点在组织和细胞水平分析DNA甲基化对lncRNA的表达调控,为揭示鸡早期性腺发育的表观遗传机制提供基础。本研究获得的研究结果如下:1.通过WGBS技术构建了鸡早期性腺全基因组DNA甲基化图谱,并揭示了其DNA甲基化模式:鸡胚性腺组织DNA在全基因组范围内有3.5%左右的C位点发生甲基化,其中CG序列环境下甲基化率为53-60%,而CHG和CHH序列环境下甲基化率只有0.13-0.18%,mCG序列环境为最主要的甲基化方式。2.对DNA甲基化组进行主成分分析和聚类分析,结果表明在胚胎期6天（E6）时期雌雄之间DNA甲基化模式较为相似,胚胎期10天（E10）时期雌雄之间甲基化差异较大,E6和E10时期甲基化模式差异较大。在E6时期雌雄间分别发现1073个DMR（CG序列环境）,其中有93个位于启动子区,120个位于外显子区,518个位于内含子区;在E10时期雌雄间分别发现1284个DMR（CG序列环境）,其中有124个位于启动子区,167个位于外显子区,714个位于内含子区。在E6和E10时期,雌雄间甲基化水平差异大于30%的DMR主要分布在Z染色体和第1、2号染色体。在E6时期,雌雄差异甲基化基因主要富集于磷酸化、大分子修饰、蛋白磷酸化、转移酶活性等生物过程。在E10时期,雌雄差异甲基化基因主要富集于代谢过程调节、转录调控、细胞代谢调控、发育过程、大分子代谢调控、细胞生物合成的调控、序列特异性DNA结合、转录因子活性等生物过程。3.采用BSP和qRT-PCR法对三个启动子差异甲基化且差异表达的长链非编码基因（ENSGALG00000051419、ENSGALG00000050012和ENSGALG00000045887）进行验证,验证结果与测序结果相符,且它们在大脑和肌肉组织中的DNA甲基化及表达水平的性别差异情况与性腺组织中一致。另外,在芳香化酶抑制剂（aromatase inhibitor,AI）处理的性反转鸡胚性腺中,ENSGALG00000051419 和 ENSGALG00000050012基因启动子区甲基化与雌性一致,而ENSGALG00000045887基因启动子区甲基化水平出现了升高;三个候选基因表达量均相较于雌性有显著下降,但表达量显著高于雄性。4.使用甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理DF-1细胞,使DNA甲基化水平整体下降,定量PCR结果显示三个候选lncRNA的表达水平与对照组相比显著上升,这表明它们的基因表达调控受到DNA甲基化的影响。5.构建了候选基因 ENSGALG00000051419 和 ENSGALG0000 0050012 启动子区的截短载体,并通过DF-1细胞和鸡原代性腺细胞中的双荧光报告基因实验找到区域可能存在转录因子结合位点对候选基因的转录激活起着重要调控作用。使用JASPAR软件预测活性核心启动子区段内可能受DNA甲基化影响的转录因子,发现了YY1、NRF1、ZEB1、Lhx8、E2F1等转录因子结合位点序列存在差异DNA甲基化。基于对鸡早期性腺进行全基因组DNA甲基化的分析结果,我们发现性别间存在DNA甲基化动态差异,并且可能在性分化相关基因的调控中起重要作用。另外用性反转模型和去甲基化处理对MHM区域进行研究的结果表明,MHM区域可能参与鸡的细胞自主性别识别过程。

关键词：鸡性腺性分化全基因组DNA甲基化转录组差异甲基化区域

鸡繁殖性能近交衰退相关CpG岛差异甲基化基因的筛选

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畜牧兽医学报 2021年第4期52卷 943-953页

作者：薛倩李国辉殷建玫张会永周成浩朱云芬邢伟杰苏一军邹剑敏韩威江苏省家禽科学研究所扬州225125 江苏省家禽科学研究所科技创新中心扬州225125

鸡繁殖性能近交衰退是地方鸡遗传资源活体保种过程中面临的重要问题之一,本研究旨在探讨全基因组CpG岛(CpG island, CGI)区DNA甲基化在鸡繁殖性能近交衰退中的作用。分别从狼山鸡高近交组和低近交组中各选取健康母鸡3只,即试验分2个组,... 详细信息

鸡繁殖性能近交衰退是地方鸡遗传资源活体保种过程中面临的重要问题之一,本研究旨在探讨全基因组CpG岛(CpG island, CGI)区DNA甲基化在鸡繁殖性能近交衰退中的作用。分别从狼山鸡高近交组和低近交组中各选取健康母鸡3只,即试验分2个组,每组3个重复,然后采用全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)技术,检测分析两组个体性腺轴组织(包括卵巢和下丘脑)全基因组DNA甲基化差异,筛选差异甲基化区域(DMRs),并对CpG岛区差异甲基化基因进行功能注释和富集分析。结果表明,狼山鸡高近交组和低近交组比较,其卵巢和下丘脑基因组整体甲基化水平均不存在显著差异(P>0.05);高、低近交组间差异甲基化区域检测发现,下丘脑和卵巢中分别检测到5 948和4 593个差异甲基化区域,其中1 798和995个差异甲基化区域位于基因组CpG岛区,分别注释到1 020和552个基因;下丘脑中,这些CpG岛区差异甲基化基因显著富集在信号转导、神经系统发育、生殖系统发育和卵母细胞成熟调控等繁殖相关的GO条目,以及转化生长因子β信号通路、乙型肝炎、脂肪酸代谢、胰岛素信号通路等19条KEGG信号通路(P差异甲基化基因显著富集于12条信号通路(P差异甲基化基因。因此,本研究在狼山鸡高、低近交组间检测到了大量差异甲基化区域,并发现大量差异甲基化基因与繁殖性状相关,推测这些基因CpG岛区DNA甲基化可能在狼山鸡繁殖性能近交衰退调控中发挥重要作用,研究结果为进一步深入探索鸡繁殖性能近交衰退调控机制奠定了基础,为物种资源保护和家禽育种工作提供了理论参考依据。

关键词：狼山鸡 DNA甲基化繁殖性能近交衰退差异甲基化区域

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DNA甲基化差异模式识别方法综述

计算机应用研究 2021年第5期38卷 1281-1286,1293页

作者：赵倩张雪张彦林正奎孙野青大连海事大学信息科学技术学院辽宁大连116026 大连海事大学环境科学与工程学院辽宁大连116026

目前,微阵列芯片技术和重亚硫酸氢盐测序技术贡献了大量DNA甲基化实验数据,基于不同数据产生了众多识别差异甲基化位点及差异甲基化区域的方法。为了对DNA甲基化差异模式识别方法进行梳理,首先介绍了DNA甲基化研究现状,包括DNA甲基化检... 详细信息

目前,微阵列芯片技术和重亚硫酸氢盐测序技术贡献了大量DNA甲基化实验数据,基于不同数据产生了众多识别差异甲基化位点及差异甲基化区域的方法。为了对DNA甲基化差异模式识别方法进行梳理,首先介绍了DNA甲基化研究现状,包括DNA甲基化检测方法和数据类型,以及两种DNA甲基化差异模式;接着详细阐述了芯片数据的差异甲基化位点和差异甲基化区域的识别方法,并介绍了基于八种不同算法原理的测序数据的差异甲基化模式识别方法,重点阐述了各种算法的原理、应用场景以及算法的优点和局限性;最后指出了现阶段DNA甲基化差异模式识别存在的问题和未来可能的发展趋势。

关键词： DNA甲基化甲基化差异模式差异甲基化位点差异甲基化区域识别

应用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立差异甲基化区CGI-2敲除小鼠

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应用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立差异甲基化区CGI-2敲除小鼠

作者：陈健哈尔滨工业大学

学位级别：硕士

Dlk1-Dio3印记区是小鼠基因组中一个重要的印记基因簇,存在多个蛋白编码基因、长非编码RNA基因,以及为数众多的micro RNA和sno RNA基因。此印记区间基因的印记表达对于胚胎发育十分重要。深入研究此印记区基因的表达调控及作用机制,对... 详细信息

Dlk1-Dio3印记区是小鼠基因组中一个重要的印记基因簇,存在多个蛋白编码基因、长非编码RNA基因,以及为数众多的micro RNA和sno RNA基因。此印记区间基因的印记表达对于胚胎发育十分重要。深入研究此印记区基因的表达调控及作用机制,对于揭示印记基因在胚胎发育中的作用及获取高质量i PS细胞具有重要意义。而目前的研究仅限于三个已知的父本甲基化的差异甲基化区(IG-DMR,Gtl2-DMR和Dlk1-DMR)对该印记区的基因表达调控。因此,寻找和鉴定新的差异甲基化区对进一步解析此印记区的基因调控机制及分子机理具有重要意义。结合本实验室前期研究发现的一个新的差异甲基化区CGI-2,本课题利用新一代基因编辑技术CRISPR/Cas9,建立差异甲基化区CGI-2敲除小鼠。我们首先设计并制备了用于sg RNA体外转录的模板和Cas9体外转录模板,然后通过显微注射方式注射到小鼠受精卵中,并将其培养至囊胚,然后移植到假孕母鼠子宫内,成功获得了一只Founder(首建小鼠)。最终移植了64枚囊胚,获得5只新生小鼠,经鉴定,有1只CGI-2单等位敲除的小鼠,总阳性率为20%。我们将Founder小鼠与野生型ICR小鼠交配,产生后代中的CGI-2单等位敲除小鼠再与Founder小鼠交配从而得到CGI-2双等位敲除小鼠。我们对3种基因型小鼠(野生型小鼠、CGI-2双等位敲除小鼠和CGI-2单等位敲除小鼠)的体征和体重的变化做了对比,发现在出生一天时,三种基因型的小鼠没有明显差异,而从出生后第一周至第四周时,体重和大小逐渐出现差异,表现为:野生型小鼠的体重和身体较大,其次是CGI-2双等位敲除小鼠,最后是CGI-2单等位敲除小鼠。而三种基因型小鼠的组织HE染色结果显示,CGI-2双等位敲除小鼠和CGI-2单等位敲除小鼠与野生型小鼠对比,肺泡间质可见大量的炎细胞,肺泡腔以及肺间质可见出血,属于支气管伴间质性肺炎及肺实变;肝细胞形态发生轻微改变;肾小球结构消失且周围炎细胞浸润,肾间质出现片状坏死的现象。该模型的建立为后续研究CGI-2的功能及其作用机制提供重要的工具,也可为其他重要基因体内功能研究提供技术借鉴。

关键词： Dlk1-Dio3印记区域差异甲基化区域显微注射 CGI-2 CRISPR/Cas9

母胎差异甲基化联合单核苷酸多态性标记建立无创性产前亲权鉴定方法的探索研究

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母胎差异甲基化联合单核苷酸多态性标记建立无创性产前亲权鉴定方...

作者：肖超华中科技大学

学位级别：硕士

研究背景近年来,随着社会的发展和需要,产前亲权鉴定案例逐年增多。目前,常规穿刺抽取羊水进行产前亲权鉴定,不仅存在胎儿损伤、流产等风险,也受到妊娠时间的限制(最佳抽取羊水时间一般在妊娠171周)。因此,找到更安全、更灵活的产前亲... 详细信息

研究背景近年来,随着社会的发展和需要,产前亲权鉴定案例逐年增多。目前,常规穿刺抽取羊水进行产前亲权鉴定,不仅存在胎儿损伤、流产等风险,也受到妊娠时间的限制(最佳抽取羊水时间一般在妊娠171周)。因此,找到更安全、更灵活的产前亲权鉴定方法一直是法医遗传学领域关注的热点之一。1997年Lo等发现孕妇血浆中存在游离胎儿DN A(Cell-free fetal DNA,cffDNA),为无创性产前亲权鉴定开辟了新的途径。CffDNA从妊娠第6周开始就可被检测到,含量随孕期增加而增加,平均约占血浆总DNA的10%,分娩后24h或更短时间内又被迅速清除,因此可在妊娠早期用于产期亲权鉴定,而且不受历史妊娠的干扰,是进行无创性产前亲权鉴定的理想生物检材。然而,cffDNA与大量母体DNA混杂在一起,除Y染色体特异性序列外,直接检测结果均为母体与胎儿混合基因型,所以难以判断父权。表观遗传学研究发现,绒毛组织与母体血细胞之间存在差异甲基化区域(Differentially methylated region,DMR),表现为胎儿甲基化、母体未甲基化,为消除母体DNA干扰提供了可能。首先采用甲基化敏感限制性内切酶(Methylation sensitive restriction enzyme,MSRE)彻底消化孕妇外周血浆DNA中的母体成分,然后PCR特异性扩增DMRs得到胎儿DNA。亲权鉴定需要进行遗传标记分型,而cffDNA多以小于200bp的短片段存在,因此单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点成为最适合的分型标记。由于SNP多态性较低,所以必须对多个位点分型才能达到亲权鉴定要求,因此联合MSRE-PCR和SNaPshot微测序技术建立复合检测体系便成为无创性产前亲权鉴定的全新策略。目的探索联合MSRE-PCR和SNaPshot微测序技术建立复合检测体系用于无创性产前亲权鉴定的可行性。方法(1)查阅相关文献,挑选出具有如下特征的DMRs:(1)包含2个双限制酶切位点组合HpaII+HinP1I或Bst UI+HinP1I;(2)胎儿绒毛或胎盘组织在识别位点甲基化,而母体外周血细胞未甲基化;(3)包含中国汉族人群高多态性SNP位点(最小等位基因频率≧0.2);(4)SNP位点与酶切位点的最远距离不超过150bp。(2)用Primer 3软件自行设计DMRs靶片段扩增引物。MSRE酶切验证甲基化状态:首先采用MSRE消化绒毛组织和配对母体血细胞样本,然后PCR扩增消化后产物,经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。通过比较目的条带的有无筛选出MSRE特异性胎儿绒毛组织甲基化、母体外周血细胞未甲基化的DMRs。(3)继续使用Primer 3软件自行设计靶片段单碱基延伸引物,并将所有DMRs根据MSRE的不同分成两组进行复合扩增检测。建立复合检测体系:先采用特异性引物扩增出包含SNP位点在内的目标DNA片段,纯化后再利用单碱基延伸引物进行各SNP位点等位基因特异性延伸反应,以此构建含多个SNP位点的复合检测体系。(4)用构建的复合检测体系对150名武汉汉族健康无关个体、4例孕妇外周血浆DNA进行分型检测。结果(1)采用MSRE-PCR验证后共挑选出14个胎儿绒毛或胎盘组织甲基化、母体血细胞未甲基化的DMRs。(2)成功构建了用于检测18个SNPs的两组复合检测体系。所有18个SNPs在武汉汉族群体中均具有遗传多态性。(3)3例孕晚期和1例孕早期孕妇外周血浆DNA酶切后SNP分型与胎儿分型完全一致。结论本文成功构建了用于检测母体外周血浆cffDNA的复合检测体系,为后续进一步改善实验结果打下基础。

关键词：无创性产前亲权鉴定 MSRE–PCR 单核苷酸多态性差异甲基化区域游离胎儿DNA 单核苷酸引物延伸反应

鉴别年龄有关的差异甲基化且差异表达基因特点

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鉴别年龄有关的差异甲基化且差异表达基因特点

作者：黄丽丽杭州电子科技大学

学位级别：硕士

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰,在胚胎发育、X染色体失活、基因组印记和染色体结构方面发挥着重要的调控作用。DNA甲基化是基因沉默和基因表达调控的重要机制。DNA甲基化和基因表达之间存在着复杂关系,到目前为止,尚未有明确定论... 详细信息

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰,在胚胎发育、X染色体失活、基因组印记和染色体结构方面发挥着重要的调控作用。DNA甲基化是基因沉默和基因表达调控的重要机制。DNA甲基化和基因表达之间存在着复杂关系,到目前为止,尚未有明确定论。目前相关领域学者针对与年龄有关的DNA甲基化进行了大量的研究,然而年龄有关的差异甲基化基因特点还不明确。本文针对这些存在的问题,研究差异甲基化区域和基因表达之间的关系,鉴别它们的特点。论文的主要研究工作和成果如下:(1)本文使用年龄间距大的匹配的DNA甲基化和基因表达的数据,基于区域方法识别出样本中与年龄有关的差异甲基化区域(DMR),并提取差异甲基化且差异表达基因。(2)为了分析差异甲基化区域的特点,本文结合基因组注释数据对其进行分析,结果发现差异甲基化区域的变化模式在基因的坐标区域内具有很高的一致性(同时高甲基化或同时低甲基化)。进一步,从差异甲基化区域分布上着手研究,结果发现高甲基化区域和低甲基化区域分布不均,分别倾向于CGI promoter基因和non CGI promoter基因上。另外,我们的研究也发现,Gene Body包含大部分差异甲基化区域(包括差异表达基因和非差异表达基因),是DNA甲基化的重要调控区域。(3)为了研究DNA甲基化与基因表达之间的关系,本文结合基因表达数据分析,结果发现非差异表达/差异上调/差异下调基因的差异甲基化区域都同时存在正关联,负关联和无关联,这一结果揭示了甲基化和基因表达间的复杂关系。进一步从细节上分析,发现差异甲基化区域的甲基化水平和基因表达之间依然存在一种倾向性,非差异表达的DMR偏向正相关,差异表达的DMR偏向负相关。(4)为了进一步分析正关联和负关联差异甲基化且差异表达基因的特点,首先,本文通过对不同数据库中蛋白质相互作用数据集成分析,构建人类蛋白质相互作用网络,并利用中心性等方法构建分类特征,对两类基因分类,我们发现利用蛋白质互作数据有助于提高两类基因分类效果。另外,通过对这两类基因进行GO富集性分析,发现两类基因的富集GO term间存在极大差异。以上结果提示两类基因与蛋白质互作的不同功能模块有关联性,两类基因很可能关联于不同的表达调控模式。

关键词：差异甲基化区域差异表达年龄分类

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低等脊椎动物中存在基因组印迹进化的基础

科学通报 2009年第8期54卷 603-609页

作者：谢冰花张蕾郑康罗琛湖南师范大学生命科学学院长沙410081 浙江大学生命科学学院杭州310058

哺乳动物配子发生过程中双亲特异性甲基化印迹导致父母双方的基因组在发育中的不等性和互补性,使父母双方的基因组对正常发育都是必需的.因此,基因组印迹是胚胎发育过程中基因组整体水平上基因表达调控至关重要的第一步,也是哺乳动物两... 详细信息

哺乳动物配子发生过程中双亲特异性甲基化印迹导致父母双方的基因组在发育中的不等性和互补性,使父母双方的基因组对正常发育都是必需的.因此,基因组印迹是胚胎发育过程中基因组整体水平上基因表达调控至关重要的第一步,也是哺乳动物两性生殖的表观遗传基础.但基因组印迹在脊椎动物中的进化起源、形成并维持稳定的表观遗传修饰分子机制都还完全不清楚.在动物界,由于至今未在非哺乳动物中发现内源印迹基因,基因组印迹被认为可能是胎生哺乳动物单独进化出来的.为探索基因组印迹的进化起源,本文研究了哺乳动物印迹基因在低等脊椎动物的同源基因中是否存在双亲特异性差异甲基化区域.通过用重亚硫酸氢盐测序的方法,对金鱼Igf2基因的CpG岛在精子、卵子、不同发育阶段胚胎以及成体不同组织中的甲基化情况进行分析,结果表明,与哺乳动物Igf2基因一样,金鱼Igf2基因内部也存在差异甲基化区域,该区域在卵子中没有甲基化,在精子中被高度甲基化;但与哺乳动物印迹基因不同,金鱼的双亲特异性甲基化差异不能在胚胎发育过程中保持稳定,可能是脊椎动物进化早期的一种初级的基因组印迹.这些结果说明,低等脊椎动物中存在基因组印迹进化的基础,基因组印迹不是哺乳动物单独进化产生的.

关键词：基因组印迹差异甲基化区域进化 Igf2 金鱼

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Dlk1-Dio3印记区域内CGI-2调控基因表达的研究

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Dlk1-Dio3印记区域内CGI-2调控基因表达的研究

作者：张栖桐哈尔滨工业大学

学位级别：硕士

Dlk1-Dio3印记基因簇位于小鼠的第十二号染色体末端(12qF1),以及人类的第14号染色体上(14q32)。该印记区域对胚胎和胎盘的生长发育起到重要的调控作用,还影响成体的新陈代谢和大脑的功能。且该区域内各基因表达在生长发育中呈现一个动... 详细信息

Dlk1-Dio3印记基因簇位于小鼠的第十二号染色体末端(12qF1),以及人类的第14号染色体上(14q32)。该印记区域对胚胎和胎盘的生长发育起到重要的调控作用,还影响成体的新陈代谢和大脑的功能。且该区域内各基因表达在生长发育中呈现一个动态变化的过程。CGI-2位于该区域内miR-341和miR-1188附近,为该区域内首个被发现的母本甲基化而父本非甲基化的差异甲基化区域,且为结合CTCF并具有绝缘子活性的DNA功能原件。因此,本文选取Dlk1-Dio3印记区域为研究对象,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对CGI-2进行长片段的基因组删除,在细胞水平上分析CGI-2敲除后其上下游基因的表达变化。首先,本文对细胞系内Dlk1-Dio3印记区域中各基因表达水平进行分析,从而筛选出三株适合敲除实验的细胞系。所选择的三株细胞系分别为Dlk1-Dio3印记区域中各基因表达水平偏高的N2a、该印记区域中各基因表达水平较低的Hepa1-6以及非癌细胞系NIH3T3。通过向导RNA预测网站设计出用于CRISPR/Cas9敲除实验的两对向导RNA,并且构建px330重组质粒。其次,在N2a细胞中进行CGI-2敲除预实验,选择适合用于实验的向导RNA。随后,分别在N2a、Hepa1-6和NIH3T3三种细胞系中进行CGI-2的CRISPR/Cas9的基因敲除,在验证敲除成功的前提下通过实时定量分析的方法判断在CGI-2缺失的情况下Dlk1-Dio3印记区域内父母本基因的表达水平变化。其结果显示,敲除位点远端的Dio3并没有明显的变化、Dlk1有不显著的下调趋势;位于次远端的Mirg呈现出上调的趋势,但在不同细胞系中其上调程度存在差异;而位于区域中间部分的Gtl2、Rtl1、Rian、Meg8、Irm和AB063319有显著的上调趋势。综上可知,CGI-2的缺失会导致Dlk1-Dio3印记区域中各基因表达水平的变化,即CGI-2对该印记区域的表达具有调控作用。最后,检验在删除CGI-2和未删除CGI-2的两种情况下Dlk1-Dio3印记区域内Dlk1-DMR、Gtl2-DMR、IG-DMR和CGI-1-DMR这四个差异甲基化区域的甲基化状态。结果显示,在删除CGI-2和未删除CGI-2的两种情况这四个差异甲基化区域均为高甲基化状态,即未发生改变。综上所述,CGI-2的缺失会导致其所在的Dlk1-Dio3印记区域内多种基因表达水平发生变化,且这种变化趋势在不同细胞系中大致相同;CGI-2对该印记区域中基因表达的调控作用与该区域内其他差异甲基化位点的甲基化状态无关。

关键词： Dlk1-Dio3印记区域差异甲基化区域 CGI-2 CRISPR/Cas9