母胎差异甲基化联合单核苷酸多态性标记建立无创性产前亲权鉴定方法的探索研究

作     者：肖超 

作者单位：华中科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄代新

授予年度：2016年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 08[工学] 0838[工学-公安技术] 100105[医学-法医学] 10[医学] 

主      题：无创性产前亲权鉴定 MSRE–PCR 单核苷酸多态性 差异甲基化区域 游离胎儿DNA 单核苷酸引物延伸反应 

摘      要：研究背景近年来,随着社会的发展和需要,产前亲权鉴定案例逐年增多。目前,常规穿刺抽取羊水进行产前亲权鉴定,不仅存在胎儿损伤、流产等风险,也受到妊娠时间的限制(最佳抽取羊水时间一般在妊娠171周)。因此,找到更安全、更灵活的产前亲权鉴定方法一直是法医遗传学领域关注的热点之一。1997年Lo等发现孕妇血浆中存在游离胎儿DN A(Cell-free fetal DNA,cffDNA),为无创性产前亲权鉴定开辟了新的途径。CffDNA从妊娠第6周开始就可被检测到,含量随孕期增加而增加,平均约占血浆总DNA的10%,分娩后24h或更短时间内又被迅速清除,因此可在妊娠早期用于产期亲权鉴定,而且不受历史妊娠的干扰,是进行无创性产前亲权鉴定的理想生物检材。然而,cffDNA与大量母体DNA混杂在一起,除Y染色体特异性序列外,直接检测结果均为母体与胎儿混合基因型,所以难以判断父权。表观遗传学研究发现,绒毛组织与母体血细胞之间存在差异甲基化区域(Differentially methylated region,DMR),表现为胎儿甲基化、母体未甲基化,为消除母体DNA干扰提供了可能。首先采用甲基化敏感限制性内切酶(Methylation sensitive restriction enzyme,MSRE)彻底消化孕妇外周血浆DNA中的母体成分,然后PCR特异性扩增DMRs得到胎儿DNA。亲权鉴定需要进行遗传标记分型,而cffDNA多以小于200bp的短片段存在,因此单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点成为最适合的分型标记。由于SNP多态性较低,所以必须对多个位点分型才能达到亲权鉴定要求,因此联合MSRE-PCR和SNaPshot微测序技术建立复合检测体系便成为无创性产前亲权鉴定的全新策略。目的探索联合MSRE-PCR和SNaPshot微测序技术建立复合检测体系用于无创性产前亲权鉴定的可行性。方法(1)查阅相关文献,挑选出具有如下特征的DMRs:(1)包含2个双限制酶切位点组合HpaII+HinP1I或Bst UI+HinP1I;(2)胎儿绒毛或胎盘组织在识别位点甲基化,而母体外周血细胞未甲基化;(3)包含中国汉族人群高多态性SNP位点(最小等位基因频率≧0.2);(4)SNP位点与酶切位点的最远距离不超过150bp。(2)用Primer 3软件自行设计DMRs靶片段扩增引物。MSRE酶切验证甲基化状态:首先采用MSRE消化绒毛组织和配对母体血细胞样本,然后PCR扩增消化后产物,经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。通过比较目的条带的有无筛选出MSRE特异性胎儿绒毛组织甲基化、母体外周血细胞未甲基化的DMRs。(3)继续使用Primer 3软件自行设计靶片段单碱基延伸引物,并将所有DMRs根据MSRE的不同分成两组进行复合扩增检测。建立复合检测体系:先采用特异性引物扩增出包含SNP位点在内的目标DNA片段,纯化后再利用单碱基延伸引物进行各SNP位点等位基因特异性延伸反应,以此构建含多个SNP位点的复合检测体系。(4)用构建的复合检测体系对150名武汉汉族健康无关个体、4例孕妇外周血浆DNA进行分型检测。结果(1)采用MSRE-PCR验证后共挑选出14个胎儿绒毛或胎盘组织甲基化、母体血细胞未甲基化的DMRs。(2)成功构建了用于检测18个SNPs的两组复合检测体系。所有18个SNPs在武汉汉族群体中均具有遗传多态性。(3)3例孕晚期和1例孕早期孕妇外周血浆DNA酶切后SNP分型与胎儿分型完全一致。结论本文成功构建了用于检测母体外周血浆cffDNA的复合检测体系,为后续进一步改善实验结果打下基础。