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中国北方地区肝硬化及肝癌患者HBV基因型及亚型分析

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中国北方地区肝硬化及肝癌患者HBV基因型及亚型分析

作者：罗晓雅郑州大学

学位级别：硕士

背景与目的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是引起慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要原因之一,全世界已有近3.5-4亿人成为慢性HBV携带者。我国是HBV感染的中高流行区,2006年的血清学调查结果表明我国一般人群HBsAg携带率为7.... 详细信息

背景与目的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是引起慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要原因之一,全世界已有近3.5-4亿人成为慢性HBV携带者。我国是HBV感染的中高流行区,2006年的血清学调查结果表明我国一般人群HBsAg携带率为7.18%,有近3000万慢性乙型肝炎患者。目前,依据全基因序列异质性差异≥8%或S区基因序列差异≥4%,将HBV分为A—H8种基因型,其中A基因型又分为两种亚型:Aa型（a代表Asia）和Ae型（e代表European）;B基因型分为Ba型（a代表Asia）和Bj型（j代表Japan）两种亚型;C基因型分为C1、C2两个亚型。近年来的研究表明HBV基因型与传播方式、疾病进展、预后以及临床抗病毒疗效等均有一定的相关性。为了解中国北方地区HBV基因型及亚型在终末期肝病病人中的分布情况,本研究采用基因型及亚型特异引物的巢式聚合酶链反应检测了101例肝硬化患者和178例原发性肝癌患者的HBV基因型及基因亚型分布,并结合临床资料分析HBV基因亚型与终末期肝病的相关性,以进一步明确不同HBV基因型致肝脏损害的差异。材料与方法 1.选取2007-2008年北方地区HBV DNA阳性的肝硬化和原发性肝细胞癌住院患者共279例。其中包括155例新鲜肝脏组织标本和124例血清标本。 2.核酸提取酚-氯仿抽提法分别提取血清和组织中的HBV-DNA。 3.行巢式聚合酶链反应对HBV-DNA进行分型。 4.使用2%的琼脂糖凝胶进行电泳。以2000DL分子量标准的Marker,作为分子量对照。 5.凝胶成像,并通过产物片段的大小来判断基因型（部分样本进行前S/S区以及X区的基因测序,以验证确定基因型）。 6.数据分析采用SPSS13.0统计软件进行统计,两均数比较使用t检验,率的比较采用卡方检验,多个样本的比较采用非参数检验。P＜0.05时认为有统计学意义。结果 1.将PCR产物在2%琼脂糖中进行电泳,根据PCR产物片段大小能清晰直观地辨别出HBV的基因型及亚型。随机选取部分样本进行前S/S区以及X区的基因测序,测序分型结果与PCR基因分型结果的符合率为100%,证实了此方法的特异性和准确性。 2.PCR结果显示,在101例肝硬化患者中,分型结果为Ba亚型的1例（0.99%）,C2亚型94例（93.07%）,Ba、C2混合型6例（5.94%）。在178例原发性肝癌患者中,分型结果为Ba亚型的6例（3.37%）,C2亚型159例（89.33%）,Ba、C2混合型13例（7.30%）。两组患者中均未检测到其他基因型。统计结果表明,两组的基因型均以C2型为主,Ba、C2亚型在肝硬化和肝癌患者中的分布无显著性差异（P＞0.05）。 3.肝硬化与肝癌患者的男女构成比有显著性差异（P＜0.05）,男性在肝癌患者中所占比例大于在肝硬化患者中所占比例。各基因亚型感染患者中男性均多于女性,C2型肝硬化和肝癌患者的男女构成比有显著性差异（P＜0.05）。肝硬化与肝癌患者的年龄分布无显著差异（P＞0.05）。经Kruskal-Walls检验,各种基因亚型在肝硬化患者和肝癌患者中的年龄分布无差别（P＞0.05）。 4.各种基因型HBeAg阳性率在肝硬化患者和肝癌患者中均无显著性差异（P＞0.05）,但肝癌患者中HBeAg阳性率明显低于肝硬化患者（P＜0.05）。 5.肝硬化和肝癌患者的TBIL水平有显著性差异（P＜0.05）,但不同基因亚型肝硬化患者、肝癌患者中TBIL的水平无显著性差异（P＞0.05）。肝硬化和肝癌患者的ALT水平无显著性差异（P＞0.05）,各种基因亚型在肝硬化患者或肝癌患者中的ALT水平无显著性差异（P＞0.05） 6.通过比较49对癌组织、癌旁组织HBV基因亚型的分布,发现有3对配对标本的基因型不同,其中癌组织均为C2型,癌旁组织均为Ba、C2混合型。结论 1.本研究结果显示肝硬化和肝癌组病例均以C基因型感染为主,B型次之。基因亚型分析结果进一步表明,所有C型标本均为C2亚型,所有B型标本均为Ba亚型,而BC混合型标本都为Ba亚型和C2亚型混合感染。 2.肝硬化和肝癌患者中各基因型及亚型的分布无显著性差异,而肝硬化及肝癌患者中的C基因型分布则显著高于慢性乙型肝炎患者。表明C基因型的HBV感染所导致的肝病病情较重,进展较快,进一步证实HBV基因型与疾病的进展预后具有相关性。 3.B、C基因型肝硬化和肝癌组患者男、女构成比均无明显差异。提示不同基因型男性和女性HBV感染者发生肝硬化以及肝癌的可能性与HBV基因型无关。 4.有3对配对组织的基因分型结果不同（经测序证实）。是否提示肝癌发生的单细胞克隆特性有待进一步验证。

关键词：乙型肝炎病毒（HBV）基因型基因亚型巢式聚合酶链反应

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人微小病毒B19与自然流产的关系研究

人微小病毒B19与自然流产的关系研究

作者：袁梦岚广西医科大学

学位级别：硕士

目的:通过分析人微小病毒B19 （HPV- B19）在自然流产组和正常妊娠组的分布情况,探讨人微小病毒B19感染与自然流产的关系。方法:无菌收集70例不同自然流产类型的母体静脉血血清400ul,其中稽留流产31例,先兆流产32例,难免流产4例,... 详细信息

目的:通过分析人微小病毒B19 （HPV- B19）在自然流产组和正常妊娠组的分布情况,探讨人微小病毒B19感染与自然流产的关系。方法:无菌收集70例不同自然流产类型的母体静脉血血清400ul,其中稽留流产31例,先兆流产32例,难免流产4例,不全流产3例;以50例同期妊娠过程正常,既往无不良妊娠史的孕妇为对照组,同法收集孕妇静脉血血清400ul。利用离心柱型病毒基因组DNA抽提试剂盒提取血清中DNA,以巢式聚合酶链反应法检测两组孕妇血清中人微小病毒B19结构蛋白DNA。结果:（1）70例自然流产组中HPV-B19 DNA阳性率为21.43%（15/70）,而50例正常妊娠组HPV-B19 DNA阳性率2%（1/50）。自然流产组的HPVB19-DNA阳性率明显高于对照组（P＜0.01）,两组之间差异有显著统计学意义。（2）32例先兆流产组HPV-B19 DNA阳性率为18.75%（6/32）,阳性率高于50例正常妊娠组（P＜0.05）,两组之间差异有统计学意义。⑶31例稽留流产组中HPV-B19 DNA阳性率为22.58%（7/31）,阳性率明显高于50例正常妊娠组（P＜0.01）,两组之间差异有显著统计学意义。⑷16例HPV-B19阳性孕妇血红蛋白及红细胞计数均低于对照组,差异有统计学意义。结论:人微小病毒B19可能是导致自然流产包括先兆流产、稽留流产等的原因之一。另外人微小病毒B19感染可能影响孕妇的血液系统,可能与病毒感染孕妇血红蛋白及红细胞计数减少存在相关性。

关键词：人微小病毒B19 巢式聚合酶链反应妊娠自然流产

巢式PCR方法在快速检测新生儿败血症病原菌中的应用

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中国卫生检验杂志 2016年第2期26卷 204-205,210页

作者：丁红辉裴磊朱沅珍孔莹莹陈肖燕义乌市妇幼保健院浙江义乌322000 浙江大学医学院附属邵逸夫医院浙江杭州310000

目的探讨巢式聚合酶链反应(PCR)方法在快速检测新生儿败血症病原菌中的应用价值。方法以细菌16S rRNA基因为扩增靶序列,设计一对所有细菌通用引物和一对革兰阴性菌特有引物,用巢式PCR方法扩增已知病原菌,检测其特异性。用巢式PCR方法和... 详细信息

目的探讨巢式聚合酶链反应(PCR)方法在快速检测新生儿败血症病原菌中的应用价值。方法以细菌16S rRNA基因为扩增靶序列,设计一对所有细菌通用引物和一对革兰阴性菌特有引物,用巢式PCR方法扩增已知病原菌,检测其特异性。用巢式PCR方法和培养法同时检测新生儿败血症血液,对2种方法的检测结果进行比较分析。结果已知实验菌株经通用引物扩增后均获得920 bp产物,革兰阴性菌经革兰阴性菌特有引物扩增后获得353 bp产物,而革兰阳性菌、人类基因组DNA、巨细胞病毒和白色假丝酵母菌无相对应产物。2种方法检测病原菌革兰分型吻合度一致,但巢式PCR方法阳性率高。结论巢式PCR方法检测新生儿败血症病原菌,具有快速、敏感度高等优点,并能对病原菌进行革兰分型,具有一定的实用价值。

关键词：巢式聚合酶链反应 16S rRNA基因新生儿败血症

湖北省首例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种的病原学诊断分析

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国际检验医学杂志 2016年第14期37卷 1956-1958页

作者：孙凌聪张华勋裴速建夏菁吴冬妮林文湖北省疾病预防控制中心寄生虫病防治研究所武汉430079

目的应用巢式PCR技术对1例罕见卵形疟原虫wallikeri亚种进行诊断和鉴定。方法采集初诊为输入性间日疟患者血样,进行疟疾快速诊断试剂盒、显微镜镜检和巢式PCR检测,并进行测序分析。结果该患者疟疾快速诊断试剂盒检测阴性;镜检查见寄生... 详细信息

目的应用巢式PCR技术对1例罕见卵形疟原虫wallikeri亚种进行诊断和鉴定。方法采集初诊为输入性间日疟患者血样,进行疟疾快速诊断试剂盒、显微镜镜检和巢式PCR检测,并进行测序分析。结果该患者疟疾快速诊断试剂盒检测阴性;镜检查见寄生于红细胞内的疟原虫环状体和滋养体;采用卵形疟原虫wallikeri亚种特异性引物(rOVA1v/rOVA2v)进行巢式PCR,在760bp处有特异性扩增条带,测序后经Blast比对,与GenBank数据库中卵形疟原虫wallikeri亚种部分序列的一致性为99%。结论该患者经巢式PCR和序列分析确诊为湖北省首例卵形疟原虫wallikeri亚种感染。

关键词：输入性疟疾卵形疟原虫wallikeri亚种巢式聚合酶链反应

巢式PCR技术检测生殖道致病性支原体的临床应用

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检验医学 2010年第11期25卷 875-878页

作者：王伟平闫李侠张仙森温州医学院附属台州市第一人民医院检验科浙江台州318020

目的探讨巢式酶链聚合反应(PCR)技术快速检测泌尿生殖道致病性支原体在临床上的应用。方法以支原体16S^23S保守区域基因为扩增靶序列设计通用引物,采用巢式PCR方法扩增微小脲原体(Up)、解脲脲原体(Uu)、生殖支原体(Mg)和人型支原体(Mh)... 详细信息

目的探讨巢式酶链聚合反应(PCR)技术快速检测泌尿生殖道致病性支原体在临床上的应用。方法以支原体16S^23S保守区域基因为扩增靶序列设计通用引物,采用巢式PCR方法扩增微小脲原体(Up)、解脲脲原体(Uu)、生殖支原体(Mg)和人型支原体(Mh)4种支原体。结果巢式PCR检测灵敏度高于一步PCR(2χ=5.857,P巢式PCR扩增出4种支原体的标准株,对1份生物样品可同时检测出4种致病性支原体,避免了误诊、漏诊,提高诊治效率。结论巢式PCR技术能快速、敏感、准确检测出Up、Uu、Mg和Mh引起的单一感染和混合感染,对于临床感染性尿道炎的早期诊断有重要意义。

关键词：巢式聚合酶链反应致病性支原体生殖道

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三种检测方法在疟疾诊断中的应用

中国热带医学 2019年第6期19卷 598-599页

作者：李明魏卓超邓晓丽许航鞍山市疾病预防控制中心

目的探讨三种检测方法在辽宁省鞍山地区疟疾诊断中的应用价值。方法分别采用镜检、疟原虫抗原快速检测(RDT)胶体金法、巢式PCR法,对鞍山地区2016-2018年16份疟疾疑似病例血样进行检测。结果镜检法、胶体金法、PCR法检测阳性率分别为62.... 详细信息

目的探讨三种检测方法在辽宁省鞍山地区疟疾诊断中的应用价值。方法分别采用镜检、疟原虫抗原快速检测(RDT)胶体金法、巢式PCR法,对鞍山地区2016-2018年16份疟疾疑似病例血样进行检测。结果镜检法、胶体金法、PCR法检测阳性率分别为62.50%、75.00%和68.75%,三种检测方法阳性率比较差异无统计学意义(P=0.748)。以镜检法为金标准,PCR法敏感性为100.00%,特异性为83.33%,以胶体金法为金标准,PCR法敏感性为83.33%,特异性为75.00%,胶体金法敏感性最强。结论在鞍山地区疟疾检测中,RDT胶体金法结合PCR法和镜检法诊断疟原虫,能有效提高诊断率。

关键词：疟疾镜检胶体金法巢式聚合酶链反应

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HIV感染者合并隐孢子虫的基因分型调查

医学动物防制 2017年第2期33卷 151-153页

作者：苏海萍黄兴锋覃勇民覃素鲜黄中元吴宁生刘柳玲张秀红河池市人民医院广西547000

目的了解河池市HIV感染者的隐孢子虫感染情况。方法收集258例HIV感染者的粪便样本,采用基于18S rRNA基因的巢式PCR方法进行检测。对巢氏PCR产物进行测序,同源性比对,明确基因型。结果河池市HIV感染者合并隐孢子虫的感染率为2.33%(6/258)... 详细信息

目的了解河池市HIV感染者的隐孢子虫感染情况。方法收集258例HIV感染者的粪便样本,采用基于18S rRNA基因的巢式PCR方法进行检测。对巢氏PCR产物进行测序,同源性比对,明确基因型。结果河池市HIV感染者合并隐孢子虫的感染率为2.33%(6/258),伴有慢性腹泻的HIV感染者合并隐孢子虫的感染率为6.98%(6/86),虫株基因鉴定为安氏隐孢子虫和人隐孢子虫。结论河池市HIV感染者存在隐孢子虫合并感染,需明确其流行特点,有待进一步调查。

关键词： HIV感染者隐孢子虫巢式聚合酶链反应

血清学和分子生物学证实云南省勐海县存在恙虫病流行

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疾病监测 2014年第9期29卷 733-736页

作者：杨杜鹃张海林苏梅惠王勇程雪琴杨卫红章域震冯云覃谊石山梅殷小栎张丽娟云南省地方病防治所/云南省病毒立克次体研究中心云南大理671000 勐海县疾病预防控制中心云南勐海666200 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所北京102206 新疆石河子大学动物科技学院新疆石河子832000

目的了解云南省勐海县恙虫病流行状况。方法 2011年6 9月,在勐海县采集恙虫病临床诊断和疑似病例急性期和恢复期血液标本,用巢式聚合酶链反应（nPCR）对患者凝血块进行恙虫病东方体（Ot）热休克蛋白（groEL）基因扩增和测序分析。用间... 详细信息

目的了解云南省勐海县恙虫病流行状况。方法 2011年6 9月,在勐海县采集恙虫病临床诊断和疑似病例急性期和恢复期血液标本,用巢式聚合酶链反应（nPCR）对患者凝血块进行恙虫病东方体（Ot）热休克蛋白（groEL）基因扩增和测序分析。用间接免疫荧光试验（IFA）检测患者血清中Ot-IgG抗体。结果 36例急性期患者凝血块标本经聚合酶链反应扩增,Ot核酸阳性25份,其中14份阳性标本被克隆和测序。同源性和进化分析显示,勐海县14株Ot的groEL区核苷酸同源性为99%～100%,氨基酸同源性均为100%,它们与来自GenBank的BJTZ-OT-O39、AH-GD-OT-S6、UT213、Kato和SH205株之间具有较高的同源性和较近的亲缘关系。17例病例双份血清经IFA检测,其中11例病例的恢复期血清IgG抗体滴度大于急性期血清4倍及以上。根据检测结果,26例病例被诊断为恙虫病（分子诊断15例和血清学诊断11例）。结论首次经血清学及分子生物学证实勐海县存在恙虫病流行。分子流行病学分析表明,勐海县Ot流行株具有稳定的遗传特点和明显的地域特征。

关键词：恙虫病监测实验室诊断巢式聚合酶链反应间接免疫荧光试验

抗人类疱疹病毒6型南京株E5单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

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抗人类疱疹病毒6型南京株E5单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

作者：姜兰兰南京医科大学

学位级别：硕士

人类疱疹病毒6型（Human herpesvirus 6,HHV-6）是一类嗜人类淋巴细胞的双链DNA病毒,于1986年由美国癌症中心的Salahuddin等首先从淋巴增生及AIDS患者外周血单个核细胞中分离到,与人类疱疹病毒7型（HHV-7）及人巨细胞病毒（CMV）同属于... 详细信息

人类疱疹病毒6型（Human herpesvirus 6,HHV-6）是一类嗜人类淋巴细胞的双链DNA病毒,于1986年由美国癌症中心的Salahuddin等首先从淋巴增生及AIDS患者外周血单个核细胞中分离到,与人类疱疹病毒7型（HHV-7）及人巨细胞病毒（CMV）同属于疱疹病毒β亚科。目前认为HHV-6是婴幼儿急疹（ES）的病因,另外还与神经胶质瘤、脑膜脑炎、AIDS、慢性疲劳综合症、器官移植后感染、多发性硬化症等多种疾病有关,但其致病机理目前尚未清楚。 HHV-6基因组为一线性双链DNA分子,大小约160～170Kbp,结构上可分为3个部分,即序列独特区（UL区）,左右末端各有一个正向重复序列（DRL和DRR区）,且有119个开放读码框（ORF）。根据其基因结构差异和抗原性可分为HHV-6A、B两种亚型,GS、U1102是HHV-6A亚型代表株,而Z29是B亚型代表株,且序列的同源性在96%以上,HHV-6广泛存在于健康成人及儿童外周血淋巴细胞和唾液中,其原发感染一般发生在6个月～2岁的婴幼儿,高峰期在6～9个月,其后在体内建立持续性感染,并长期呈潜伏感染。我室于1994年在国内首次分离鉴定出HHV-6南京地方株8株,并详细研究了南京株E5（CN5）的病毒学、免疫学、生物学特性及病毒形态学超微结构,为本次研究奠定了良好的基础。本研究采用蔗糖密度梯度离心法纯化的南京株HHV-6 E5病毒抗原免疫8周龄、雌性BALB/c小鼠,采用常规方法融合,间接ELISA方法筛选,并经3次有限稀释法亚克隆后,获得3株能持续稳定分泌特异性抗HHV-6抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为JA9、JYE7、JYE8。将获得的3株杂交瘤细胞株传代扩增,注射到用Pristane预刺激的BALB/c小鼠体内制备腹水,并进行初步纯化。单抗Ig亚类鉴定表明:JA9为IgG1,κ亚型、JYE7和JYE8为IgM,λ亚型;腹水效价分别为1:0.8X10~5、1:0.256X10~5、1:0.128 X10~5;杂交瘤细胞染色体计数显示3株细胞染色体数均约95条以上;间接免疫荧光实验显示:3株单抗均能与HHV-6 E5感染的CBMCs呈阳性反应,而与未感染CBMCs呈阴性反应;其中JA9单抗Western-blot实验结果进一步表明其可与HHV-6 E5约75ku大小的病毒蛋白结合。本研究收集口腔肿瘤（口腔鳞癌及其癌前病变）、脑肿瘤（神经胶质瘤及脑膜瘤）、婴幼儿急疹、免疫抑制剂使用者（肾移植及肾病综合症）及健康人群唾液标本分别为41份、40份、36份、37份、40份,共194份。采用巢式PCR及ELISA法检测唾液标本中HHV-6的阳性率,结果患者的HHV-6阳性检出率均高于健康人群且有统计学意义。本研究在自分离鉴定的HHV-6南京株E5的基础上,成功制备并初步鉴定出3株抗人类疱疹病毒6型南京株E5的单克隆抗体,将为HHV-6的进一步研究奠定基础,并为临床诊断提供了可能。

关键词：人类疱疹病毒6型南京株E5 单克隆抗体巢式聚合酶链反应 ELISA法唾液标本