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食油假单胞菌利用甘油合成PHA与新型PHA嵌合酶构建研究

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食油假单胞菌利用甘油合成PHA与新型PHA嵌合酶构建研究

作者：王美玲辽宁大学

学位级别：硕士

聚羟基饱和脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate, PHA)是某些细菌在碳源丰富而氮源匮乏的条件下产生的一种生物聚酯。PHA有着良好的生物可降解性、生物相容性、憎水性以及由不同官能团带来的独特性质,被用作组织工程材料药物缓释材料,是一种... 详细信息

聚羟基饱和脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate, PHA)是某些细菌在碳源丰富而氮源匮乏的条件下产生的一种生物聚酯。PHA有着良好的生物可降解性、生物相容性、憎水性以及由不同官能团带来的独特性质,被用作组织工程材料药物缓释材料,是一种有很好发展潜力的生物材料。然而,生物合成PHA时出现的单体组分单一、产率低和成本高等问题,严重制约着PHA的广泛应用,还不能满足各领域对于其的需求。目前,PHA的主要生产方法是微生物发酵,如何降低PHA的生产成本和提高产出率,如何改变PHA组分,进而改变PHA的物理和化学性能,已成为当下研究的热点。研究表明,微生物合成PHA的组分及含量受到底物成分的影响,底物成本占到PHA总生产成本的28-50%,采用廉价底物将在很大程度上降低PHA的生产成本,而生物柴油在生产过程中产生的主要副产物是甘油(粗甘油),利用甘油合成PHA既可以解决生物柴油生产过程中带来的环境污染问题,又可以降低PHA的生产成本。PHA合酶是PHA合成过程中的关键酶,决定着PHA组分中单体的类型和PHA的产率,通过改造PHA合酶实现PHA单体成分的改变和提高产率理论是可行的。基因工程是目前合酶改造中应用最多的技术,其主要是在分子层面上来改变合酶,以期能够改变合酶的单体组成、提高催化活性等。通过融合两个或者更多的PHA酶构建嵌合酶,探究对PHA合酶的分子改造机制已成为许多学者研究的热点。在本研究中,我们主要做了两方面工作：一方面,利用实验室现有的食油假单胞菌进行了其利用甘油和乙酰丙酸混合碳源的发酵研究。既能充分利用在生物柴油生产过程中产生的粗甘油,解决与其相关的一系列环境污染问题,又能通过改变PHA单体成分的含量来改变PHA性能。另一方面,以食油假单胞菌和富氧产碱菌、起皱假单胞菌和恶臭假单胞菌分别为出发菌株,利用SOE PCR技术构建了Ⅰ型PHA嵌合酶和Ⅱ型PHA嵌合酶,以生产含有新组分的PHA。研究结果如下：(1)食油假单胞菌利用甘油发酵培养基的优化。配制一系列含有不同浓度梯度甘油和乙酰丙酸的MS培养基,通过摇瓶发酵和气相色谱(GC)检测分析PHA产量和组分。结果表明,食油假单胞菌可在以甘油和乙酰丙酸为混合碳源的发酵培养基中产生共聚物PHB-PHV,且共聚物中各组分的含量与甘油和乙酰丙酸的浓度有一定关系。(2)Ⅰ型PHA嵌合酶构建研究。富氧产碱菌(Ralstonia eutropha)能够利用多种碳源作为底物生长,且只合成3-羟基丁酸酯(PHB)。食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)能够很好的利用甘油产PHA,但是其生产PHA能力较低。利用在线数据库Predtor、GOR4、SOPMA分别对PhaCpo和PhaCRe的氨基酸预测分析其二级结构,采用生物分析软件Vector NTI 6.0对两个酶进行序列比对,找到二者PHA合酶的最佳嵌合位点。通过SOE PCR技术可以构建得到含有二者合酶基因的嵌合酶基因phaCPoRe,并构建重组菌R. eutropha PHB-4-pBBR1MCS2-phaCPoRe,摇瓶发酵重组菌,收集菌体称重获得CDW,通过GC验证PHA嵌合酶活性。通过与短链以及中长链标准品的气相色检测保留时间对比,可以得知,带有二者嵌合酶基因PhaCPoRe的重组菌***-4-pBBR1MCS2-phaCPoRe,能够利用合适的碳源生长并合成PHA。如：在以甘油、葡萄糖酸钠、果糖为碳源的培养基中,能够很好的生长,只产生PHB,在以月桂酸、辛酸钠为碳源的培养基中可以生长,合成了不同比例的3-HB且产生新的组分3-HO的PHA单体。实验结果说明构建的Ⅰ型PHA嵌合酶具有活性,而且能够利用合适的碳源产PHA。(3)Ⅱ型PHA嵌合酶构建研究。从起皱假单胞菌PHA合酶基因(PhaCpc)和恶臭假单胞菌PHA合酶基因(PhaCpp)出发,利用在线数据库Predtor、GOR4、 SOPMA分别对PhaCpc和PhaCPp的氨基酸预测分析其二级结构,采用生物分析软件Vector NTI 6.0对两个酶进行序列比对,找到二者PHA合酶的最佳嵌合位点。通过SOE PCR技术可以构建得到含有二者合酶基因的嵌合酶基因phaCPcPp,并构建重组菌P. putida GPp 104-pBBR1MCS2-PhaCPcPp,摇瓶发酵重组菌,收集菌体称重获得CDW,通过GC验证PHA嵌合酶活性。通过与短链以及中长链标准品的气相色检测保留时间对比,可以得知,带有二者嵌合酶基因PhaCPcPp的重组菌P. putida GPp 104-pBBR1MCS2-PhaCPcPp,能够利用合适的碳源生长并合成PHA。实验证明,重组菌P. putida GPp 104-pBBR1MCS2-PhaCPcPp能够在

关键词：聚羟基饱和脂肪酸酯(PHA) 甘油嵌合酶

假单胞菌利用甘油合成PHA与新型PHA嵌合酶构建研究

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假单胞菌利用甘油合成PHA与新型PHA嵌合酶构建研究

作者：赵小慧辽宁大学

学位级别：硕士

聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate, PHAs）是细菌在碳源充足、氮源缺乏的情况下产生的作为胞内碳源和能源储存物的生物聚酯，其具有良好的生物相容性、生物可降解性、光学活性、压电性、气体相隔性等独特性质，在医药、组织工程、... 详细信息

聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate, PHAs）是细菌在碳源充足、氮源缺乏的情况下产生的作为胞内碳源和能源储存物的生物聚酯，其具有良好的生物相容性、生物可降解性、光学活性、压电性、气体相隔性等独特性质，在医药、组织工程、化妆品、农业、工业上具有广泛应用，是当今生物材料领域最有前景最为活跃的研究热点之一。然而，目前PHA的生物合成由于产率低、成本高、单体组分单一等问题，还不能满足各领域对于新型生物材料的需求，严重制约着PHA的广泛应用。目前PHA生产主要依赖于微生物发酵，在微生物发酵合成PHA的所有发酵条件因素中，底物是一个重要因素，其成本占到总成本的28-50%。采用廉价底物将在很大程度上降低PHA的生产成本。粗甘油是生物柴油在生产过程中产生的主要副产物（甘油），利用甘油合成PHA既可以解决甘油过度积累带来的废水、废气等环境污染的问题，又可以降低PHA的生产成本。但是当以粗甘油为底物合成PHA时，由于生物柴油副产物中甘油的高渗透压，PHA的积累比例会严重下降。如何解决甘油高渗透压问题成为利用生物柴油副产物合成PHA的关键。烯醇酶（Enolase）是一个抗逆性基因，是糖酵解途径中的关键酶，能催化2-磷酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇式丙酮酸。带有烯醇酶基因的假单胞菌能更好的在甘油高渗透压逆性环境中生存。本研究针对假单胞菌利用粗甘油生产PHA出现的低产率问题，做了两方面工作：一是对实验室保存的可合成PHA的三株假单胞菌进行甘油耐受力评估，筛选出甘油耐受力比较好的菌株;二是利用基因工程技术克隆抗逆性基因——烯醇酶基因，构建重组菌，以提高菌株耐受甘油能力。针对PHA产生过程中成分单一的问题，利用SOE PCR技术以富氧产碱菌（R. eutropha）PHA合酶基因（PhaCRe）和嗜水气单胞菌WQ（A. hydrophila WQ）PHA合酶基因（PhaCAh）为亲本，构建嵌合酶，以产生新型的PHA。研究结果如下：（1）三株假单胞菌的甘油耐受力评估。对实验室筛选得到的三株假单胞菌（*** ZJ03, *** ZJ166, P. corrugata CY06）在含有不同浓度梯度甘油矿物盐培养基中进行发酵，并通过气相色谱法（GC）分析确认其PHA产率，对各菌株利用甘油生产PHA的能力及甘油耐受度进行评估，结果表明，*** ZJ03的甘油耐受性比较好。（2）烯醇酶基因克隆及酶活力测定。利用PCR技术从P. putida KT2442基因组DNA中扩增烯醇酶基因，构建pET28a-Eno表达质粒，转化进入大肠杆菌BL21（DE3），筛选转化子，经测序及序列比对，证明克隆的基因为烯醇酶基因（序列号为JQ864251）。将重组菌接种于LB培养基培养，当OD达到0.6时，用1mM IPTG诱导4小时，离心收集菌体细胞。超声波破碎菌体，上清液经Ni-NTA亲和层析柱纯化，获得蛋白Enolase，分子量大小为46kD。获得的烯醇酶蛋白酶活力经分光光度计直接测得酶活力为510.9U/L。（3）构建产新型PHA嵌合酶。PHA成分单一极大地限制了PHA的广泛应用。嵌合体构建是创造新酶的一种方法。PHA合酶是PHA合成过程中的关键酶，它的活性和底物特异性决定着PHA的含量和组成。对PHA合酶进行基因工程改造可以改变PHA合酶的底物特异性、提高催化活性、改变单体组成、获得新型PHA。本研究为获得具有双亲酶活性的酶，从富氧产碱菌（R. eutropha）PHA合酶基因（PhaCRe）和嗜水气单胞菌WQ（A. hydrophila WQ）PHA合酶基因（PhaCAh）出发，用数据库对PhaCRe和PhaCAh的二级结构进行预测，找到两个酶的合适的结合位点，利用这个结合位点，构建嵌合酶基因PhaCAhRe。将嵌合基因连接到组成型表达载体pBBR1MCS2上构建重组质粒，将重组质粒pBBR1MCS2-PhaCAhRe结合转化入R. eutropha PHB-4中。利用加入不同碳源的矿物盐培养基，30℃，200rpm条件下摇瓶发酵重组菌，72h后收集菌体称重并做GC验证嵌合PHA合酶活性。结果表明，嵌合菌株AHRE在以葡萄糖酸钠和果糖为碳源时，只产PHB。在以辛酸钠、月桂酸、油酸、辛酸钠和葡萄糖酸钠混合物为碳源时，与亲本相比，除了产生3HB和3HHx，还产生了新的组分3HO。当以辛酸钠和葡萄糖酸钠混合碳源发酵时，PHA含量最高，为57.54%。当以辛酸钠为单一碳源时，3HO单体组成含量最高，占PHA总量的1.932%。表明嵌合酶构建成功，获得了新型PHA。综上所述，本研究筛选出具有甘油耐受力比较好的菌株，构建的抗逆性基因烯醇酶基因经诱导表达后具有酶活。这对提高菌株对高甘油浓度的耐受力，利用价

关键词：聚羟基饱和脂肪酸酯(PHA) 甘油烯醇酶嵌合酶

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SOE-PCR法构建新型PHA嵌合酶研究

辽宁大学学报（自然科学版） 2021年第3期48卷 277-282页

作者：赵小慧张卉妍胡风庆辽宁省经济作物研究所辽宁辽阳111000 辽宁大学轻型产业学院辽宁沈阳110036

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanonate,PHA)合酶是PHA合成过程中的关键酶,其活性和底物特异性决定PHA含量和单体组成.构建嵌合酶是改变PHA单体组成的一种有效方式.利用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension,SOE-PCR)法,以... 详细信息

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanonate,PHA)合酶是PHA合成过程中的关键酶,其活性和底物特异性决定PHA含量和单体组成.构建嵌合酶是改变PHA单体组成的一种有效方式.利用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension,SOE-PCR)法,以富氧产碱菌和嗜水气单胞菌PHA合酶基因为亲本构建新的PHA嵌合酶.结果表明,带有新型嵌合酶基因的重组菌株AHRE可利用葡萄糖酸钠和果糖产生3HB.利用辛酸钠、月桂酸、油酸、辛酸钠和葡萄糖酸钠混合碳源,除3HB和3HHx外,还产生了新的单体组分3HO.辛酸钠和葡萄糖酸钠混合碳源发酵,PHA含量最高,达57.54%.辛酸钠为单一碳源时,3HO单体组成含量最高,占PHA总量1.932%,证明嵌合酶构建成功.这为今后利用基因工程技术改变菌株PHA单体组成提供了有效方法,为获得具有更好材料学特性的PHA奠定了工作基础.

关键词：聚羟基饱和脂肪酸酯(PHA) PHA合酶嵌合酶

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新型嵌合脂解酶的设计及其酶学性质表征

新型嵌合脂解酶的设计及其酶学性质表征

作者：陈品怡华南理工大学

学位级别：硕士

嵌合酶是指由两种或两种以上酶的不同功能片段融合而成并呈现出新催化特性的酶分子。其出现及其相关技术的发展为酶工程的研究和应用提供了新策略。利用蛋白质工程技术构建嵌合酶来实现酶的底物选择偏好性改变一直是科学研究热点。基于... 详细信息

嵌合酶是指由两种或两种以上酶的不同功能片段融合而成并呈现出新催化特性的酶分子。其出现及其相关技术的发展为酶工程的研究和应用提供了新策略。利用蛋白质工程技术构建嵌合酶来实现酶的底物选择偏好性改变一直是科学研究热点。基于此,本研究以Rhizomucor miehei来源的脂肪酶RML为研究对象,与实验室前期研究已挖掘出具有磷脂酶活力调控功能的蛋白元件嵌合,构建系列新型嵌合脂解酶,开展其酶学性质表征研究,重点考察磷脂酶活力变化及底物选择偏好性的变化规律。相关研究为脂解酶的结构功能关系研究提供了良好的基础,为利用蛋白元件设计酶分子强化催化性能提供科学指导依据。具体研究内容及结果如下:(1)基于蛋白元件重构的新型嵌合脂解酶的设计、制备及酶学性质表征。通过对4个蛋白元件的排列、重复、组合,共设计5个嵌合体(1-5号嵌合体)。构建嵌合体毕赤酵母表达菌株,通过高密度发酵培养、阴离子交换层析纯化获得嵌合体重组蛋白,表征嵌合体的脂肪酶和磷脂酶活力。结果显示,5个嵌合体的磷脂酶活力均有不同程度的提升,其中5号嵌合体的磷脂酶比活力为35.77 U/mg,是野生型的82倍。2号嵌合体的磷脂酶比活力为27.10 U/mg,其磷脂酶比酶活力/脂肪酶比酶活力为1.11,更加偏好水解磷脂底物。(2)基于活性口袋周围微环境重构的嵌合酶设计、制备及酶学性质表征。对位于嵌合体活性口袋周围的非极性氨基酸和带电氨基酸开展极性和带电性改造,重构活性口袋微环境,共设计14个嵌合酶突变体,对其脂肪酶和磷脂酶活力进行表征。结果显示,提高活性口袋周围微环境的极性或电负性均有利于进一步提高嵌合酶对磷脂底物的水解能力。其中,突变体H的磷脂酶比活力为69.52 U/mg,是野生型的160倍。研究发现通过改变反应温度可调控突变体H底物偏好性。当反应温度为20℃时脂肪酶水解活力最高,40℃时磷脂酶水解活力最高。将突变体H应用于大豆毛油脱胶中,在加酶量10 U/g,反应温度45℃,p H 4.0的条件下,反应6 h大豆毛油中的磷含量由162.0mg/kg降至9.2 mg/kg。(3)嵌合脂解酶底物选择性机制研究。通过蛋白质结构预测,分别模拟出突变体H闭合和开放构象的三维结构。进行突变体H和RML WT与磷脂底物和甘油三酯底物的分子对接,结果显示突变体H与两种底物的结合能均大于RML WT。突变体H嵌合的蛋白元件位于活性口袋上方,有助于加强底物与活性口袋的结合。嵌合的蛋白元件上的极性氨基酸有助于固定磷脂底物的亲水头部,使磷脂底物结合在正确位置,促进活性中心对磷脂底物的水解。

关键词：脂肪酶磷脂酶嵌合酶分子改造

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工程化胺脱氢酶辅酶结合域的分子改造

工程化胺脱氢酶辅酶结合域的分子改造

作者：李佳琳江南大学

学位级别：硕士

NADH依赖型胺脱氢酶(Am DH)催化前手性酮和游离氨的不对称还原胺化途径具有反应条件温和、绿色高效及产物光学纯度高等优点,广泛应用于重要结构砌块和医药中间体手性胺的合成。对于底物结合域和辅酶结合域相互独立的Am DH,近年来主要的... 详细信息

NADH依赖型胺脱氢酶(Am DH)催化前手性酮和游离氨的不对称还原胺化途径具有反应条件温和、绿色高效及产物光学纯度高等优点,广泛应用于重要结构砌块和医药中间体手性胺的合成。对于底物结合域和辅酶结合域相互独立的Am DH,近年来主要的研究集中在对Am DH底物结合口袋关键位点的分子改造,提高Am DH底物催化活力或者拓宽其底物谱,但对辅酶结合域的改造报道较少。本研究通过对Am DH辅酶结合域进行分子改造,获得高辅酶亲和力的Am DH,提高不对称还原胺化的催化效率进而降低工业生产成本,为Am DH的工业化应用奠定基础。本论文的具体研究内容如下:(1)通过将源于Bacillus cereus的亮氨酸胺脱氢酶(L-Bc Am DH)的高辅酶亲和力辅酶结合域替换源于Bacillus badius的苯丙氨酸胺脱氢酶(F-Bb Am DH)辅酶结合域,构建获得一种新的嵌合胺脱氢酶c FLF-Am DH。使用自诱导培养基可使c FLF-Am DH实现可溶性高效表达。c FLF-Am DH辅酶亲和力(K)较F-Bb Am DH的提高了2倍,对于天然底物对氟苯基丙酮(p FPA)的活性提高了150%。c FLF-Am DH酶学性质研究结果表明,其最适反应p H为10.0,最适反应温度为60℃。与亲本F-Bb Am DH相比,c FLF-Am DH的热稳定性提高了160%。(2)分子对接研究表明c FLF-Am DH对于底物p FPA作用的关键位点残基作用力的距离缩短,是催化活力提高的主要原因。分子动力学模拟(MD)和结合能结果表明,c FLF-Am DH与NADH复合物的RMSD的波动范围较F-Bb Am DH与NADH复合物小,并且c FLF-Am DH的RMSF值比F-Bb Am DH低,说明c FLF-Am DH的结构较亲本F-Bb Am DH更稳定。不对称还原胺化反应结果表明,当辅酶浓度为0.5 m M时,c FLF-Am DH可达到99%的转化率。(3)基于与高辅酶亲和力的亮氨酸胺脱氢酶(L-Bc Am DH和L-Es Am DH)的序列比对,选择对辅酶结合口袋附近的2个氨基酸残基(D155和K193)分别进行饱和突变和组合突变,最终获得一个辅酶亲和力和催化效率显著提高的突变株F-Bb Am DH(D155L/K193N),突变株F-Bb Am DH(D155L/K193N)对辅酶NADH的K值为0.01 m M。(4)分子对接和酶与NADH复合物的分子动力学模拟结果表明,F-Bb Am DH的D155位点被亮氨酸(L)取代后影响了相邻残基间接改变酶与NADH之间的相互作用,K193位点被天冬酰胺(N)取代后与NADH的焦磷酸盐部分形成了更紧密的氢键。不对称还原胺化反应结果表明,当辅酶浓度为0.1 m M时,突变株F-Bb Am DH(D155L/K193N)在1 h内可达到99%的转化率。综上所述,针对工程化Am DH具有两个独立的结构域的特点,对工程化Am DH的辅酶结合域进行分子改造可获得对辅酶亲和力显著提高的突变株,进而提高催化效率,降低生产成本。

关键词：胺脱氢酶辅酶亲和力嵌合酶辅酶结合域分子改造

淀粉结合域与α-淀粉酶的融合表达及其酶学性质

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生物加工过程 2010年第5期8卷 39-43页

作者：杨键金辉王青艳黄日波广西大学生命科学与技术学院广西亚热带生物资源保护利用重点实验室南宁530005 广西科学院国家非粮生物质能源研究工程中心南宁530007

利用RT-PCR从Rhizopus oryzaeGX-08总RNA中克隆到糖化酶的淀粉结合域(SBD)基因(sbd),将该基因片段插入α-淀粉酶(CN7A)基因cn7a的5′端构建融合表达质粒pSE-sbdcn7a。嵌合酶SBD-CN7A在Escherichia coliJM109表达,并经Ni-NTA、Sephacryl S300纯化。酶学性质研究表明:嵌合酶在最适作用条件方面与原始酶并无明显差别;在以生玉米粉为底物时,其比酶活提高了8.7倍,而以可溶性淀粉为底物时其比酶活是原始酶的1.8倍,Km也从3.784 g/L降低为2.234 g/L;嵌合酶在65℃下的半衰期从10 min缩短为4 min。结果表明,淀粉结合域SBD的融合赋予了α-淀粉酶CN7A水解生淀粉的能力。

关键词：嵌合酶淀粉结合域热稳定性

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蛋白质合理设计改变嗜热酯酶的底物选择性

蛋白质合理设计改变嗜热酯酶的底物选择性

作者：高乐吉林大学

学位级别：硕士

酶底物选择性及稳定性是酶分子的重要性质。应用结构生物学及生物信息学等理论方法进行新酶设计是酶工程研究的重要内容。本文在对脂肪酶结构-功能关系分析的基础上,以Aeropyrum pernix K1嗜热酯酶APE1547的α/β水解酶折叠结构域为骨架... 详细信息

酶底物选择性及稳定性是酶分子的重要性质。应用结构生物学及生物信息学等理论方法进行新酶设计是酶工程研究的重要内容。本文在对脂肪酶结构-功能关系分析的基础上,以Aeropyrum pernix K1嗜热酯酶APE1547的α/β水解酶折叠结构域为骨架,应用计算机模拟进行新酶设计,将中温脂肪酶candida rugosa lipase1的lid结构合理地连接到该骨架上,构建了嵌合酶( chimeric enzyme)AL,实验表明该嵌合酶在90℃时具有很好的生物学稳定性,并对长链脂肪酸底物有较好的亲和力;为进一步提高嵌合酶的催化效率,经进一步分子设计,在嵌合酶AL的α/β结构域“嫁接”( grafting)了脂肪酶底物结合区域的保守肽段,构建新嵌合酶“ALI”,其对底物对硝基苯酚辛酸酯表现出与AL相似的活性,酶学性质的表征正在进行中。本研究工作为探讨酶底物特异性转换提供了新思路,为酶的分歧进化提供了新的实验证据。

关键词：酯酶脂肪酶底物特异性蛋白质设计嵌合酶

大肠杆菌L-门冬酰胺酶Ⅱ作为多肽呈现载体的可行性研究

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药物生物技术 2006年第3期13卷 159-165页

作者：林洁黄永城王学军吴洁刘景晶中国药科大学生命科学与技术学院江苏南京210009

为了研究大肠杆菌L-门冬酰胺酶Ⅱ(L-asparaginaseⅡ,AnsB)能否作为多肽呈现载体。选取乙肝病毒表面抗原(HBSAg)preS2结构域的核心抗原表位区作为模型多肽,构建了两种表达载体pET28a-AnsB-preS2L和pET28a-AnsB-preS2C,分别转化至表达宿主... 详细信息

为了研究大肠杆菌L-门冬酰胺酶Ⅱ(L-asparaginaseⅡ,AnsB)能否作为多肽呈现载体。选取乙肝病毒表面抗原(HBSAg)preS2结构域的核心抗原表位区作为模型多肽,构建了两种表达载体pET28a-AnsB-preS2L和pET28a-AnsB-preS2C,分别转化至表达宿主菌***-21,LB培养基(Kanr)培养,乳糖诱导高效表达,通过渗透休克,DEAE 52-cellulose柱层析纯化获得了在AnsB C端融合有线状和环状模型多肽的嵌合酶AnsB-preS2L和AnsB-preS2C,两种嵌合酶分别保留了AnsB 81%、25%的催化活力,两者的pH稳定性均与AnsB相符。ELISA检测结果显示AnsB-preS2L与抗preS2抗体的结合能力较AnsB-preS2C强。证明AnsB确实能够作为一种表面呈现载体将线性外源多肽以融合表达的方式呈现在酶分子的表面,最终形成一种在每个亚基表面呈现有多肽的嵌合酶。最后,用富含带电序列的8肽(KRKRKKSR)替换核心抗原表位区作为模型多肽,进一步验证了AnsB作为多肽呈现载体的可行性和通用性。

关键词： L-门冬酰胺酶Ⅱ 嵌合酶表面呈现外源多肽抗原表位表位扫描