热稳定性嵌合酶的分子设计、可溶性表达与性质研究

作     者：张宇航 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：冯雁

授予年度：2007年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100701[医学-药物化学] 10[医学] 

主      题：α/β水解酶超家族 嵌合酶 理性设计 底物选择性 可溶性表达 

摘      要：来源于古细菌Aeropyrum pernix K1嗜热酰基氨肽酶(APE1547)与来源于古细菌Archaeoglobus fulgidus的嗜热酯酶(AFEST)具有结构上相似的α/β水解酶折叠结构域(RMSD为2.6),但二者在催化性能与底物特异性上却存在着明显的差异。本文以分子设计为手段,采用结构域重组的方法,研究α/β水解酶超家族中α/β水解酶结构域以外的结构区域对于酶底物选择性和稳定性的影响。 本文应用LPC/CSU服务器(Ligand-Protein Contacts & Contacts of Structural Units)分析了天然AFEST与APE1547结构中α/β水解酶结构域与其他结构域之间连接区域的结构特征,选取两亲本之间作用模式最相似的位点作为重组位点,将AFEST的cap结构与APE1547 R526V突变体的α/β水解酶折叠结构域相融合;以同源建模程序Modeller建立了嵌合酶的分子模型,通过PROCHECK等软件对模型评估;突变了一些最有可能影响重组蛋白可溶性的残基;经过对培养和纯化条件的优化,最终获得了可溶性的嵌合酶AAM6;结果显示AAM6保留了双亲本的热稳定性特性;与APE1547相比,丧失了肽酶活力,而存在可检测的酯酶活力,并且其底物特异性偏向短链底物。分子动力学模拟(Molecular Dynamic)为这一实验现象作出了说明。 本文通过理性设计的方法,实现了α/β水解酶超家族非同源性蛋白之间的重组,为进一步研究α/β水解酶超家族中“标准α/β结构以外的结构元件对其底物特异性的影响提供了实验依据。