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新城疫与H9N2亚型禽流感嵌合型病毒样颗粒的构建与鉴定

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黑龙江畜牧兽医 2018年第17期 122-125页

作者：李红丽闫巍文王红宝郭雪丽张晋强王志宇王毅山西省农业科学院畜牧兽医研究所太原030032 华南农业大学动物科学学院广州510642

为了构建新城疫与H9N2亚型禽流感嵌合型病毒样颗粒（cVLP）,试验以目前流行的基因Ⅶ型新城疫病毒和H9N2亚型禽流感病毒为研究对象,通过昆虫杆状病毒表达系统构建了3种重组杆状病毒,分别为rBV-M、rBV-HN及r BV-FHA,并以适当比例感染悬浮... 详细信息

为了构建新城疫与H9N2亚型禽流感嵌合型病毒样颗粒（cVLP）,试验以目前流行的基因Ⅶ型新城疫病毒和H9N2亚型禽流感病毒为研究对象,通过昆虫杆状病毒表达系统构建了3种重组杆状病毒,分别为rBV-M、rBV-HN及r BV-FHA,并以适当比例感染悬浮昆虫Sf9细胞,经蔗糖密度梯度纯化后获得嵌合型病毒样颗粒,同时采用新城疫和H9亚型禽流感标准阳性血清对嵌合型病毒样颗粒进行血凝和血凝抑制试验。结果表明：嵌合型病毒样颗粒以新城疫病毒M蛋白作为颗粒骨架,插入了新城疫病毒HN蛋白和经F蛋白胞内域融合的禽流感病毒HA蛋白,在电镜下观察纯化的嵌合型病毒样颗粒具有完整的囊膜结构及纤突,该颗粒具有结合两种阳性血清的能力。说明试验成功构建了包含有新城疫病毒M蛋白、HN蛋白和H9亚型禽流感病毒HA蛋白的嵌合型病毒样颗粒,并且保留了良好的生物学活性。

关键词：基因Ⅶ型新城疫病毒 H9N2亚型禽流感嵌合型病毒样颗粒构建鉴定

新城疫-H9N2亚型禽流感嵌合型病毒样颗粒免疫效果分析

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黑龙江畜牧兽医 2020年第12期 133-136页

作者：李红丽闫巍文王红宝郭雪丽张伟业刘源王志宇山西省农业科学院畜牧兽医研究所太原030032 华南农业大学动物科学学院广州510642

为了测定新城疫-H9N2亚型禽流感嵌合型病毒样颗粒(ND-H9N2 VLPs)作为疫苗候选株的免疫效果,试验将ND-H9N2 VLPs联合铝佐剂制成ND-H9N2 VLPs疫苗,测定ND-H9N2 VLPs疫苗的最小免疫剂量及一次超剂量接种的安全性。选取7日龄非免疫雏鸡30只... 详细信息

为了测定新城疫-H9N2亚型禽流感嵌合型病毒样颗粒(ND-H9N2 VLPs)作为疫苗候选株的免疫效果,试验将ND-H9N2 VLPs联合铝佐剂制成ND-H9N2 VLPs疫苗,测定ND-H9N2 VLPs疫苗的最小免疫剂量及一次超剂量接种的安全性。选取7日龄非免疫雏鸡30只,随机分为3组,每组10只。第1组为ND-H9N2 VLPs联合佐剂免疫组,以350μL/只的剂量进行皮下注射免疫;第2组为商品疫苗组[鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(La Sota株+F株)]依照商品说明书进行免疫;第3组为阴性对照组,以相同方式注射同等剂量的生理盐水;初免两周后,以同等剂量和免疫方式进行加强免疫,加强免疫3周后,所有鸡用新城疫强毒TY-1株和H9N2亚型禽流感病毒SX-1株进行滴鼻、点眼攻毒,每周定时进行鸡翅下静脉采血,分离血清,用血凝抑制试验测定每只鸡的抗体效价,攻毒后连续14 d每天定时观察各组鸡群的临床症状,统计死亡数,计算免疫保护率。结果表明:ND-H9N2 VLPs疫苗的最小免疫剂量为30μg蛋白/只,用此疫苗以5倍剂量进行免疫,免疫鸡未出现新城疫、禽流感临床症状,表明此疫苗安全性良好。ND-H9N2 VLPs联合铝佐剂免疫组与商品疫苗组比,两组鸡在临床症状和存活率上表现一致,在抵抗当前流行毒株的感染时,都能够提供100%保护作用;两组鸡免疫后新城疫和H9亚型禽流感抗体效价都是在第5周达到峰值,之后缓慢下降,但是ND-H9N2 VLPs联合铝佐剂疫苗免疫组鸡的血清抗体效价与商品疫苗比要相对高些。说明本试验研制的ND-H9N2 VLPs作为疫苗候选株具有很大的防控优势。

关键词：新城疫病毒 H9N2亚型禽流感病毒嵌合型病毒样颗粒安全性免疫效果血清抗体

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嵌合型口蹄疫病毒样颗粒构建、表达及鉴定

生物工程学报 2020年第7期36卷 1305-1313页

作者：刘绒欢郭慧琛杜平董虎郭梦楠孙世琪中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室OIE/国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

为提高口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)病毒样颗粒(Virus-likeparticles,VLPs)的特异性识别和递呈,为靶向疫苗研究奠定基础,利用反向PCR技术,将卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)第257–264位氨基酸(Amino acids,aa)的短肽嵌入FMDV结构蛋白VP3第171–172位aa或第173–174位aa,通过大肠杆菌表达FMDV结构蛋白VP0、VP1和嵌合型VP3,体外组装得到嵌合OVA257-264肽的病毒样颗粒(VLPOVA)。用动态光散射、透射电镜检测VLPOVA大小和形态,免疫印迹、酶联免疫吸附试验和激光共聚焦显微镜检测短肽的嵌入情况。结果显示在VP3的第173–174位aa嵌入OVA,不影响蛋白表达和VLPs的组装且OVA位于VLPOVA的表面,VLPOVA粒径比VLPs稍大。

关键词：口蹄疫病毒嵌合型病毒样颗粒 OVA257-264 VP3

南非2型口蹄疫病毒样颗粒体外组装及嵌合病毒样颗粒的初步研究

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南非2型口蹄疫病毒样颗粒体外组装及嵌合病毒样颗粒的初步研究

作者：董虎中国农业科学院

学位级别：硕士

病毒样颗粒作为最接近自然病毒粒子但不含病毒基因的类病毒颗粒能够诱导近乎病毒自然感染的免疫力,被认为目前最有优势的候选疫苗。具有自组装能力的病毒衣壳蛋白都可以通过真核表达系统或原核表达系统自组装VLPs,但相比而言原核表达系... 详细信息

病毒样颗粒作为最接近自然病毒粒子但不含病毒基因的类病毒颗粒能够诱导近乎病毒自然感染的免疫力,被认为目前最有优势的候选疫苗。具有自组装能力的病毒衣壳蛋白都可以通过真核表达系统或原核表达系统自组装VLPs,但相比而言原核表达系统体外组装VLPs操作简易、周期短、成本低、效率高,且体外组装的VLPs作为疫苗不存在安全隐患。因此通过大肠杆菌表达体系体外制备南非2型口蹄疫病毒样颗粒疫苗对于全球预防控制南非2型口蹄疫病毒爆发至关重要。一方面本文基于口蹄疫衣壳蛋白VP0、VP3、VP1在体外具有自组装能力,原核表达可溶性口蹄疫病毒衣壳蛋白His6-SUMO-VP0, His6-SUMO-VP3和His6-SUMO-VP1,切除衣壳蛋白肽链N端的His6-SUMO标签使衣壳蛋白在特定组装体系中自组装VLPs。VLPs组装条件研究发现衣壳蛋白在中性偏碱性或碱性溶液中都会组装成VLPs或组装前体,随着离子强度逐渐增加VLPs组装效率逐渐提高,且低浓度的钙离子能够促进VLPs的组装,37℃条件下蛋白容易降解或团聚沉淀不利于VLPs组装。研究表明衣壳蛋白体外组装倾向于疏水作用和共价键结合,蛋白质分子之间相互作用使蛋白质分子以稳定状态存在,高盐使溶液的疏水作用增加有利于蛋白质分子间共价键形成且有利于单体或组装前体相互聚集促进VLPs形成。另一方面基于口蹄疫VLPs目前的研究进展本研究还对嵌合型口蹄疫VLPs进行了初步研究。将FLAG (DYKDDDDK)序列通过融合PCR技术嵌入口蹄疫结构蛋白VP1GH-loop可变区,原核表达的可溶性口蹄疫衣壳蛋白VPO、VP3和嵌合型VP1体外组装VLPs。结果显示：在缓冲体系中标签蛋白被切除后衣壳蛋白VP0、VP3和FLAGVP1组装成VLPs,其大小约25nnm左右。结果表明：FLAG序列成功插入GH-loop可变区第150-151氨基酸位点之间,外源多肽的插入不影响VLPs空间构象。本研究首次通过体外组装条件摸索组装出南非2型口蹄疫病毒VLPs,同时尝试性的对组装VLPs的应用价值进行初步研究。FLAG嵌合型VLPs的成功组装表明：组装的VLPs不仅仅局限于疫苗研究领域VLPs可作为纳米级材料应用于纳米生物研究领域作为药物、核酸和蛋白的靶向递释载体或VLPs携带标记物用于诊断和病毒致病机理性研究等等。但南非2型口蹄疫病毒VLPs及嵌合型VLPs的免疫效果尚待进一步的研究验证。

关键词：南非2型口蹄疫病毒病毒样颗粒嵌合型病毒样颗粒原核表达

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嵌合型口蹄疫病毒样颗粒组装研究

安徽农业科学 2014年第13期42卷 3902-3906页

作者：董虎郭慧琛敖大韩世充闫丹刘湘涛孙世琪中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疾病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

[目的]为研究和制备多联或多价口蹄疫病毒样颗粒疫苗奠定基础。[方法]将FLAG序列通过融合PCR技术插入口蹄疫结构蛋白VP1GH-loop可变区,并通过大肠杆菌原核表达技术表达口蹄疫病毒衣壳蛋白VP0、VP3和嵌合型VP1,在体外组装出嵌合FLAG外源... 详细信息

[目的]为研究和制备多联或多价口蹄疫病毒样颗粒疫苗奠定基础。[方法]将FLAG序列通过融合PCR技术插入口蹄疫结构蛋白VP1GH-loop可变区,并通过大肠杆菌原核表达技术表达口蹄疫病毒衣壳蛋白VP0、VP3和嵌合型VP1,在体外组装出嵌合FLAG外源多肽的口蹄疫病毒样颗粒。[结果]大肠杆菌表达的口蹄疫衣壳蛋白主要以可溶性存在,在缓冲体系中融合标签被切除衣壳蛋白VP0、VP3和FLAGVP1组装成病毒样颗粒,其大小约25 nm左右。FLAG序列成功插入GH-loop可变区第150-151氨基酸位点之间,外源多肽的插入没有影响衣壳蛋白VP1的空间结构。[结论]口蹄疫loop可变区引入外源抗原是可行的,但外源多肽的大小及理化性质会影响病毒样颗粒的组装效率。

关键词：口蹄疫病毒原核表达 GH-loop 嵌合型病毒样颗粒

嵌合IBDV B细胞表位的PCV2b病毒样颗粒的制备及其免疫活性

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嵌合IBDV B细胞表位的PCV2b病毒样颗粒的制备及其免疫活性

作者：孙晓萌吉林大学

学位级别：硕士

嵌合型病毒样颗粒是一种通过基因融合、化学偶联等方式呈现外源性多肽的改良型病毒样颗粒（VLP）,近年来成为疫苗研究领域的热点。为了探索其在原核系统中构建、组装的策略,我们以猪圆环病毒（PCV2b）衣壳蛋白作为骨架,以预测的传染性... 详细信息

嵌合型病毒样颗粒是一种通过基因融合、化学偶联等方式呈现外源性多肽的改良型病毒样颗粒（VLP）,近年来成为疫苗研究领域的热点。为了探索其在原核系统中构建、组装的策略,我们以猪圆环病毒（PCV2b）衣壳蛋白作为骨架,以预测的传染性法氏囊病毒（IBDV）衣壳蛋白B细胞表位作为插入的外源性多肽,用大肠杆菌系统表达了基因融合的嵌合蛋白并在体外将其组装成嵌合型病毒样颗粒。该颗粒可刺激小鼠产生IBDV特异性抗体。本研究为搭建嵌合型病毒样颗粒平台提供了参考和设计思路。

关键词：嵌合型病毒样颗粒 B细胞表位传染性法氏囊病毒猪圆环病毒衣壳蛋白

滴鼻接种HPV16 L1-E7 DNA初始引发及HPV16 L1 VLP强化免疫可增强小鼠黏膜和细胞免疫

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基础医学与临床 2006年第11期26卷 1196-1200页

作者：栾怡于修平赵蔚明于瑾杨宁唐伟山东大学医学院医学微生物学教研室山东济南250012 济南市第五人民医院骨外科山东济南250022

目的探讨HPV16 L1-E7 DNA疫苗初始引发及HPV16L1病毒样颗粒(VLP)强化接种小鼠诱发免疫反应的效应,为进一步用于HPV16相关恶性肿瘤的防治提供实验依据。方法以HPV16 L1-E7嵌合蛋白、HPV16 L1 VLP以及HPV16 L1-E7 DNA单独或联合滴鼻免疫雌... 详细信息

目的探讨HPV16 L1-E7 DNA疫苗初始引发及HPV16L1病毒样颗粒(VLP)强化接种小鼠诱发免疫反应的效应,为进一步用于HPV16相关恶性肿瘤的防治提供实验依据。方法以HPV16 L1-E7嵌合蛋白、HPV16 L1 VLP以及HPV16 L1-E7 DNA单独或联合滴鼻免疫雌性BALB/c小鼠,连续使用3周。免疫后采血及收集阴道分泌物,检测特异性抗体。在末次免疫2周后,取小鼠脾细胞,用HPV 16 L1-E7蛋白刺激,检测T细胞增殖反应及IFN-γ水平。结果HPV16 L1-E7嵌合蛋白滴鼻接种可诱导小鼠产生血清HPV16 L1特异性IgG,强化免疫后抗体水平明显增高(P嵌合病毒样颗粒HPV16 L1-E7和HPV16 L1-E7 DNA疫苗初始引发及HPV16 L1蛋白强化滴鼻接种适用于预防HPV原发性黏膜感染和治疗HPV16相关肿瘤。

关键词：乳头瘤病毒人嵌合型病毒样颗粒动物实验 DNA初始引发

HPV16L1-E7蛋白疫苗诱导小鼠产生抗体及细胞免疫应答的研究

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山东大学学报（医学版） 2002年第4期40卷 302-304页

作者：栾怡于修平宋长芹卞继峰阎世坤赵蔚明贾继辉周亚滨齐眉山东大学医学院微生物学教研室

目的 :探讨嵌合性病毒样颗粒HPV1 6L1 E7蛋白疫苗接种于动物体内诱发体液和细胞免疫反应的能力。方法 :以本室构建的HPV1 6L1 E7嵌合蛋白疫苗腹腔注射免疫BALB/c小鼠 ,在初次免疫后 ,分别于第 3、4、5周采血ELISA检测特异性抗体的产... 详细信息

目的 :探讨嵌合性病毒样颗粒HPV1 6L1 E7蛋白疫苗接种于动物体内诱发体液和细胞免疫反应的能力。方法 :以本室构建的HPV1 6L1 E7嵌合蛋白疫苗腹腔注射免疫BALB/c小鼠 ,在初次免疫后 ,分别于第 3、4、5周采血ELISA检测特异性抗体的产生。并耳皮下注射HPV1 6L1蛋白 ,检测特异性DHT反应。在末次免疫 2周后 ,取小鼠脾细胞 ,用HPV 1 6L1 E7蛋白刺激 ,检测T细胞增殖反应及血清IFN γ水平。结果 :HPV1 6L1 E7蛋白疫苗免疫小鼠可有效产生HPV1 6L1抗体及特异性DTH反应 ,加强免疫后 ,抗体水平升高 ,两者水平均高于对照组 (P 嵌合蛋白疫苗免疫后取小鼠脾细胞 ,在特异性HPV1 6L1 E7蛋白抗原刺激下 ,特异性T淋巴细胞明显增殖。被免疫小鼠血清中出现高水平IFN γ。结论 :嵌合病毒样颗粒HPV1 6L1 E7蛋白可诱导小鼠产生高滴度抗体、HPV1 6L1特异性TDH参与的超敏反应及细胞免疫应答的细胞因子。

关键词：人乳头状瘤病毒嵌合型病毒样颗粒疫苗实验动物

人乳头瘤病毒的致癌机理及其疫苗的临床试验研究

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国外医学（病毒学分册） 2005年第5期12卷 133-136页

作者：范江涛陈心秋田厚文广西南宁广西医科大学第一附属医院妇科 100052 北京中国疾病预防控制中心病毒病研究所 530021

高危型人乳头瘤病毒(HPV)是引起宫颈癌的重要原因。诸多类型的HPV疫苗已经进入临床试验。在预防性疫苗中,嵌合型病毒样颗粒(cVLP)取得了不错的效果;在治疗性疫苗中,人们尝试了多肽疫苗,蛋白疫苗,DNA疫苗,病毒载体疫苗和联合免疫等方式,... 详细信息

高危型人乳头瘤病毒(HPV)是引起宫颈癌的重要原因。诸多类型的HPV疫苗已经进入临床试验。在预防性疫苗中,嵌合型病毒样颗粒(cVLP)取得了不错的效果;在治疗性疫苗中,人们尝试了多肽疫苗,蛋白疫苗,DNA疫苗,病毒载体疫苗和联合免疫等方式,可以检测到所诱发的特异性免疫反应,但临床效果并不满意。无论预防性疫苗还是治疗性疫苗都面临着许多挑战。

关键词：人乳头瘤病毒疫苗临床试验高危型人乳头瘤病毒临床试验研究预防性疫苗致癌机理嵌合型病毒样颗粒特异性免疫反应治疗性疫苗病毒载体疫苗 HPV疫苗