南非2型口蹄疫病毒样颗粒体外组装及嵌合病毒样颗粒的初步研究

作     者：董虎 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：孙世琪

授予年度：2014年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：南非2型口蹄疫病毒 病毒样颗粒 嵌合型病毒样颗粒 原核表达 

摘      要：病毒样颗粒作为最接近自然病毒粒子但不含病毒基因的类病毒颗粒能够诱导近乎病毒自然感染的免疫力,被认为目前最有优势的候选疫苗。具有自组装能力的病毒衣壳蛋白都可以通过真核表达系统或原核表达系统自组装VLPs,但相比而言原核表达系统体外组装VLPs操作简易、周期短、成本低、效率高,且体外组装的VLPs作为疫苗不存在安全隐患。因此通过大肠杆菌表达体系体外制备南非2型口蹄疫病毒样颗粒疫苗对于全球预防控制南非2型口蹄疫病毒爆发至关重要。 一方面本文基于口蹄疫衣壳蛋白VP0、VP3、VP1在体外具有自组装能力,原核表达可溶性口蹄疫病毒衣壳蛋白His6-SUMO-VP0, His6-SUMO-VP3和His6-SUMO-VP1,切除衣壳蛋白肽链N端的His6-SUMO标签使衣壳蛋白在特定组装体系中自组装VLPs。VLPs组装条件研究发现衣壳蛋白在中性偏碱性或碱性溶液中都会组装成VLPs或组装前体,随着离子强度逐渐增加VLPs组装效率逐渐提高,且低浓度的钙离子能够促进VLPs的组装,37℃条件下蛋白容易降解或团聚沉淀不利于VLPs组装。研究表明衣壳蛋白体外组装倾向于疏水作用和共价键结合,蛋白质分子之间相互作用使蛋白质分子以稳定状态存在,高盐使溶液的疏水作用增加有利于蛋白质分子间共价键形成且有利于单体或组装前体相互聚集促进VLPs形成。 另一方面基于口蹄疫VLPs目前的研究进展本研究还对嵌合型口蹄疫VLPs进行了初步研究。将FLAG (DYKDDDDK)序列通过融合PCR技术嵌入口蹄疫结构蛋白VP1GH-loop可变区,原核表达的可溶性口蹄疫衣壳蛋白VPO、VP3和嵌合型VP1体外组装VLPs。结果显示：在缓冲体系中标签蛋白被切除后衣壳蛋白VP0、VP3和FLAGVP1组装成VLPs,其大小约25nnm左右。结果表明：FLAG序列成功插入GH-loop可变区第150-151氨基酸位点之间,外源多肽的插入不影响VLPs空间构象。 本研究首次通过体外组装条件摸索组装出南非2型口蹄疫病毒VLPs,同时尝试性的对组装VLPs的应用价值进行初步研究。FLAG嵌合型VLPs的成功组装表明：组装的VLPs不仅仅局限于疫苗研究领域VLPs可作为纳米级材料应用于纳米生物研究领域作为药物、核酸和蛋白的靶向递释载体或VLPs携带标记物用于诊断和病毒致病机理性研究等等。但南非2型口蹄疫病毒VLPs及嵌合型VLPs的免疫效果尚待进一步的研究验证。