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猪-狒狒嵌合体尿酸氧化酶的表达、纯化及酶学性质研究

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中国医药工业杂志 2022年第8期53卷 1148-1154页

作者：汪柯欣王亚鹏路建光杨桂英化浩举冯军浙江工业大学长三角绿色制药协同创新中心浙江杭州310014 中国医药工业研究总院上海201203 复旦大学药学院上海201203 上海多米瑞生物技术有限公司上海201203

报道了猪-狒狒嵌合体尿酸氧化酶(1)的发酵表达、分离纯化、活性测定及酶学性质分析。采用重组大肠埃希菌高密度发酵技术,以包涵体形式表达1,发酵产量为6.88 g/L。包涵体经碱溶液提取、阴离子交换柱色谱纯化后得到纯度为99.61%的目的蛋白... 详细信息

报道了猪-狒狒嵌合体尿酸氧化酶(1)的发酵表达、分离纯化、活性测定及酶学性质分析。采用重组大肠埃希菌高密度发酵技术,以包涵体形式表达1,发酵产量为6.88 g/L。包涵体经碱溶液提取、阴离子交换柱色谱纯化后得到纯度为99.61%的目的蛋白,总酶活收率为78.95%。样品经质谱鉴定和酶活性分析,单亚基相对分子质量正确,比活达到6.25 u/mg,证明自制重组1在大肠埃希菌中成功表达,且具有降解尿酸的能力。本研究为1类药物的高效率制备提供了方法学借鉴。

关键词：尿酸氧化酶重组表达发酵纯化酶学性质

低剂量尿酸氧化酶治疗儿童侵袭性成熟B细胞淋巴瘤并高尿酸血症106例

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中华实用儿科临床杂志 2022年第18期37卷 1377-1381页

作者：张梦段彦龙金玲杨菁黄爽聂晓璐李楠张楠张楠楠张永红国家儿童医学中心首都医科大学附属北京儿童医院儿童肿瘤中心肿瘤内科北京市儿童血液肿瘤重点实验室儿科重大疾病研究教育部重点实验室北京100045 国家儿童医学中心首都医科大学附属北京儿童医院临床流行病与循证医学中心北京100045

目的探讨低剂量尿酸氧化酶治疗儿童侵袭性成熟B细胞淋巴瘤并高尿酸血症的可行性。方法回顾性研究2016年1月至2021年6月首都医科大学附属北京儿童医院收治的并高尿酸血症的初治侵袭性成熟B细胞淋巴瘤患儿临床资料, 患儿均于化疗前1 d至... 详细信息

目的探讨低剂量尿酸氧化酶治疗儿童侵袭性成熟B细胞淋巴瘤并高尿酸血症的可行性。方法回顾性研究2016年1月至2021年6月首都医科大学附属北京儿童医院收治的并高尿酸血症的初治侵袭性成熟B细胞淋巴瘤患儿临床资料, 患儿均于化疗前1 d至化疗第7天监测血清尿酸水平, 超过正常上限时静脉滴注低剂量尿酸氧化酶[0.05~0.10 mg/(kg·次)], 总结尿酸氧化酶治疗效果以及临床用药经验。应用不同剂次尿酸氧化酶患儿治疗前后血清尿酸水平的比较采用重复测量方差分析。结果共纳入合并高尿酸血症的初治侵袭性成熟B细胞淋巴瘤患儿106例, 其中男88例, 女18例;中位年龄6.5(3.5, 10.0)岁;病理亚型包括伯基特淋巴瘤95例(89.6%)、高级别B细胞淋巴瘤7例(6.6%)、弥漫大B细胞淋巴瘤4例(3.8%);临床分期Ⅲ期39例(36.8%)、Ⅳ期67例(63.2%)。患儿均存在高肿瘤负荷, 其中肾脏受累52例(49.1%), 合并肿瘤溶解综合征42例(39.6%), 合并急性肾损伤27例(25.5%)。全组患儿累计应用尿酸氧化酶1剂次41例(38.7%)、2剂次41例(38.7%)、3剂次20例(18.9%)、4剂次4例(3.8%), 辅以连续性肾脏替代治疗9例(8.5%)。化疗前、首剂尿酸氧化酶后12 h血清尿酸水平分别为(741.4±312.9) μmol/L、(210.8±148.6) μmol/L, 二者比较差异有统计学意义(t=5.288, P尿酸氧化酶患儿治疗前后血清尿酸水平随时间变化趋势进行比较, 差异无统计学意义(F=0.225, P=0.879)。化疗28 d内未发生因肿瘤溶解综合征以及急性肾损伤导致的化疗延迟和死亡。结论低剂量、按需应用尿酸氧化酶可快速有效降低侵袭性成熟B细胞淋巴瘤患儿化疗早期血清尿酸水平。

关键词：尿酸氧化酶淋巴瘤高尿酸血症肿瘤溶解综合征儿童

鸭源产尿酸氧化酶菌株的筛选及其降尿酸能力评估

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饲料研究 2023年第19期46卷 64-68页

作者：叶胜强麻燕明杨宇童新红李中心钱运国龚萍武汉市农业科学院湖北武汉430208 湖北洪山实验室湖北武汉430070 华中农业大学动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室湖北武汉430070

试验旨在从鸭粪便中筛选具有高产尿酸氧化酶的菌株,为缓解和治疗家禽高尿酸血症提供新的解决方案。试验从健康肉鸭新鲜粪便中筛选能在尿酸筛选培养基上产生透明圈的菌株,采用平板点种法测定菌株的产酶活性,采用16S rDNA测序法进行分子... 详细信息

试验旨在从鸭粪便中筛选具有高产尿酸氧化酶的菌株,为缓解和治疗家禽高尿酸血症提供新的解决方案。试验从健康肉鸭新鲜粪便中筛选能在尿酸筛选培养基上产生透明圈的菌株,采用平板点种法测定菌株的产酶活性,采用16S rDNA测序法进行分子鉴定。试验菌株拌料饲喂樱桃谷鸭评定饲用效果,并评估候选菌株对高尿酸樱桃谷鸭的影响。结果显示,初步筛选出56株产尿酸氧化酶的菌株,其中1株有产蛋白酶能力、7株有产淀粉酶能力;91%的菌株为革兰氏阴性菌,对27株进行分子鉴定,15株为产碱杆菌属。菌株AS1、P56分别与粪产碱杆菌、瓜里科假单胞菌同源性最高。菌株AS1、P56对鸭平均日采食量、体重无明显影响,AS1可显著降低高尿酸血症鸭的血清尿酸水平(P尿酸筛选培养基可从鸭粪便中筛选出高产尿酸氧化酶的菌株,AS1可作为候选菌株为后续缓解和治疗家禽高尿酸血症提供参考。

关键词：鸭尿酸氧化酶产碱杆菌高尿酸血症

产尿酸氧化酶菌株的筛选、鉴定及其功能基因研究

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产尿酸氧化酶菌株的筛选、鉴定及其功能基因研究

作者：刘红艳大理大学

学位级别：硕士

尿酸氧化酶(Urate oxidase,Uox)是生物体嘌呤代谢的关键酶,在嘌呤代谢路径中起着重要作用。尿酸氧化酶广泛存在于细菌、真菌和许多动植物中,然而人、猿等灵长类等动物的尿酸氧化酶基因在进化过程中发生突变,使尿酸氧化酶基因成为“假基... 详细信息

尿酸氧化酶(Urate oxidase,Uox)是生物体嘌呤代谢的关键酶,在嘌呤代谢路径中起着重要作用。尿酸氧化酶广泛存在于细菌、真菌和许多动植物中,然而人、猿等灵长类等动物的尿酸氧化酶基因在进化过程中发生突变,使尿酸氧化酶基因成为“假基因”。因此,尿酸成为人体内嘌呤代谢的终产物,浓度过高时,会引发高尿酸血症、痛风等疾病。目前,尿酸氧化酶已被利用于尿酸检测和部分临床疾病的治疗,然而,关于尿酸氧化酶的研究还相对不足。因此,新的尿酸氧化酶功能菌株和功能基因的发掘十分迫切。本研究的主要内容和结果如下:1.功能菌株的筛选及鉴定:经富集培养和分离筛选得到具有尿酸降解功能的菌株117株,经16S r RNA基因测序鉴定和系统发育分析,将117株产酶菌株确定为23个属。通过水解圈大小和产尿酸氧化酶活性挑选出活性较高的8株菌株,分属于链霉菌Streptomyces sp.(YHBJ-12和2YHDJ-2)、芽孢杆菌Bacillus sp.(YHBJ-8和2YHBJ-3)、节杆菌Arthrobacter sp.(CSAJ-12、CSAJ-16和YHBJ-11)和微杆菌Microbacterium sp.(YHDJ-3)。2.功能基因的扩增和克隆:基于NCBI数据库尿酸氧化酶功能基因序列设计兼并引物,以功能菌株基因组为模板成功克隆了来源于YHBJ-12、2YHDJ-2、CSAJ-12、CSAJ-16、YHBJ-11的尿酸氧化酶基因,并进行克隆和异源表达。3.酶学性质研究:测定温度、pH、金属离子和抑制剂等因子,对尿酸氧化酶活性的影响,研究其酶学性质。结果表明本研究获得尿酸氧化酶的最适反应pH在pH 5.0～7.0之间,最适反应温度都在20℃～25℃。不同来源的尿酸氧化酶对金属离子和抑制剂的敏感性各异。在pH 3.0～9.0之间,处理24 h仍能保持20%以上的酶活;在最适温度及最适温度上下两个梯度(重组酶还有37℃)温度条件处理下,尿酸氧化酶能在长时间(80 min)内保持60%以上的活性。这些研究结果表明,土壤环境中蕴含着丰富的产尿酸氧化酶功能菌株,本研究中获得的功能菌株和功能基因,为尿酸氧化酶的开发利用提供重要的酶源储备。

关键词：尿酸尿酸氧化酶功能菌株功能基因酶学性质

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高产尿酸氧化酶基因工程菌的构建

高产尿酸氧化酶基因工程菌的构建

作者：贺壮壮北京化工大学

学位级别：硕士

本文选用毕赤酵母X-33作为宿主,分别对黄曲霉来源、微细菌ZZJ4-1来源、假丝酵母来源、枯草芽孢杆菌来源的尿酸氧化酶基因进行了异源表达,通过对胞内胞外酶活的测定,发现黄曲霉来源的尿酸氧化酶基因在毕赤酵母X-33中的表达量以及分泌量最... 详细信息

本文选用毕赤酵母X-33作为宿主,分别对黄曲霉来源、微细菌ZZJ4-1来源、假丝酵母来源、枯草芽孢杆菌来源的尿酸氧化酶基因进行了异源表达,通过对胞内胞外酶活的测定,发现黄曲霉来源的尿酸氧化酶基因在毕赤酵母X-33中的表达量以及分泌量最高,胞外酶活为0.122 U/m L,胞内酶活为1.6 U/m L,因此选用了黄曲霉来源的尿酸氧化酶基因作为目的基因。为了使更多的酶分泌到胞外,对酿酒酵母α-MF信号肽进行了优化,以及对内源信号肽和外源信号肽进行了大量的筛选,包括10种内源信号肽和8种外源信号肽。在初始α-MF信号肽的作用下,摇瓶中的胞外酶活为0.122 U/m L,5 L生物反应器中的胞外酶活为0.201 U/m L。在经过大量筛选之后得到了2种对于尿酸氧化酶分泌性较强的信号肽,分别是信号肽Fre 2和信号肽Dse 4,摇瓶中胞外酶活分别为0.474 U/m L和0.426 U/m L,相对α-MF信号肽分别提高了3.88倍和3.5倍。在5 L生物反应器中的胞外酶活分别为10.8 U/m L和8.4 U/m L,分别是α-MF信号肽分泌效果的51.4倍和41.8倍。在以Fre 2作为分泌信号肽的基础之上,对尿酸氧化酶分泌途径中的相关模块进行了优化,包括转录因子模块、内质网分子伴侣模块、易位蛋白模块、囊泡COPⅡ转运模块、泛素化模块、磷酸戊糖途径模块、抗氧化模块七个模块进行了探究,发现对于尿酸氧化酶的分泌有较大促进作用的是囊泡COPⅡ模块的Sar 1蛋白,对Sar 1过表达之后,胞外酶活为0.662U/m L,相对提高了39.7%,过表达Uso1后,胞外酶活为0.597 U/m L,相对提高了25.9%,易位蛋白相关的YDJ 1、Sec 61过表达之后胞外酶活分别为0.637 U/m L,0.6 U/m L,分别提高了34.4%、26.6%。在5 L生物反应器中菌株XFU-Sar 1、XFU-Uso 1、XFU-Sec 61、XFU-YDJ 1的胞外最高酶活分别达到11.4 U/m L、10.96 U/m L、10.86 U/m L、11.2 U/m L。推断过表达相关基因后的菌株在5 L生物反应器中的胞外酶活没有明显提高的原因是发酵后期前体供应不足或者分泌受限。

关键词：尿酸氧化酶毕赤酵母信号肽分泌途径

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尿酸氧化酶固定化应用于高尿酸血症研究进展

高师理科学刊 2022年第11期42卷 63-66页

作者：汪志伟任梦飞夏觅真吴琳梅安徽医科大学生命科学学院安徽合肥230032

高尿酸血症是严重影响身体健康和生活质量的一大疾病.尿酸氧化酶(UOX)能够催化尿酸生成水溶性尿素囊,从而降低尿酸水平,起到治疗高尿酸血症的作用.但是,UOX作为一种外源性蛋白质,存在体内稳定性低、半衰期短、抗原性强、治疗价格高等问... 详细信息

高尿酸血症是严重影响身体健康和生活质量的一大疾病.尿酸氧化酶(UOX)能够催化尿酸生成水溶性尿素囊,从而降低尿酸水平,起到治疗高尿酸血症的作用.但是,UOX作为一种外源性蛋白质,存在体内稳定性低、半衰期短、抗原性强、治疗价格高等问题,限制了其在临床上的使用.通过酶的固定化技术,可以克服UOX的缺点,扩大其在治疗高尿酸血症上的应用.对UOX的固定化及其应用于高尿酸血症的相关研究进行综述,旨在为UOX类药物开发提供参考.

关键词：高尿酸血症尿酸氧化酶固定化酶载体材料

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尿酸氧化酶的表达纯化及活性形式鉴定

军事医学科学院院刊 2005年第2期29卷 124-126,131页

作者：吴伟立李彦英苗林徐金森方宏清陈惠鹏军事医学科学院生物工程研究所北京100071 厦门大学肿瘤细胞教育部重点实验室厦门361005

目的:在大肠杆菌内表达具有活性的黄曲霉尿酸氧化酶。方法:用重叠PCR从黄曲霉(Aspergillusflavus)3.1398中钓取了尿酸氧化酶(urateoxidase,UO,EC1.***.3.3)基因,克隆到原核表达载体pET22b中,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选到高表达的重组转... 详细信息

目的:在大肠杆菌内表达具有活性的黄曲霉尿酸氧化酶。方法:用重叠PCR从黄曲霉(Aspergillusflavus)3.1398中钓取了尿酸氧化酶(urateoxidase,UO,EC1.***.3.3)基因,克隆到原核表达载体pET22b中,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选到高表达的重组转化子菌株。经乳糖诱导目的蛋白表达,阴离子交换柱纯化,获得纯品。SDS PAGE分析样品纯度。用尿酸缓冲液测定酶活性,用戊二醛交联结合质谱法测定相对分子质量。结果:目的蛋白为胞内可溶性表达,表达量达菌体总蛋白的35%,纯化后的样品纯度达99%,其酶比活力可达35U/mg。经质谱测定重组UO单体的相对分子质量为34×103。交联后相对分子质量为160×103。结论:黄曲霉尿酸氧化酶可在大肠杆菌中可溶表达,并具有活性,其活性形式为四聚体。

关键词：尿酸氧化酶重组蛋白质类大肠杆菌共价交联聚合酶链反应

尿酸氧化酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定

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中国生物工程杂志 2011年第4期31卷 83-86页

作者：朱蕾王庆民武国栋薛彤彤孙丽霞王晶翼齐鲁制药有限公司药物研究院济南250100

尿酸氧化酶(urate oxidase,Uricase,EC.1.***.3.3)是一种能将尿酸氧化为尿囊素的蛋白酶。合成黄曲霉(Aspergillus flavus)尿酸氧化酶基因,构建表达载体pET43.1a/uox,重组质粒经双酶切鉴定和序列分析,证明插入序列正确,转化到大肠杆菌(Esch... 详细信息

尿酸氧化酶(urate oxidase,Uricase,EC.1.***.3.3)是一种能将尿酸氧化为尿囊素的蛋白酶。合成黄曲霉(Aspergillus flavus)尿酸氧化酶基因,构建表达载体pET43.1a/uox,重组质粒经双酶切鉴定和序列分析,证明插入序列正确,转化到大肠杆菌(Escherichia coli)JM109,菌株经诱导表达尿酸氧化酶蛋白,目的蛋白经过超声破碎,经检测以可溶性蛋白为主;菌体经超声破碎后,上清经过阴离子柱和阳离子柱两步纯化,得到尿酸氧化酶纯品,纯品以分光光度法进行体外酶活性测定。结果显示:尿酸氧化酶在大肠杆菌中获得高效表达,目的蛋白占菌体总蛋白的50%;表达产物经过两步层析柱纯化,获得电泳扫描纯度为95%的纯品;在体外活性测定中具有分解尿酸的能力,在临床检测和治疗中有重要意义。

关键词：尿酸氧化酶大肠杆菌高效表达纯化

芽孢杆菌属来源产尿酸氧化酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究

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生物过程 2022年第4期12卷 233-241页

作者：闫鑫王帅刘红艳柳清清胡平桑鹏尹以瑞大理大学农学与生物科学学院云南大理

尿酸氧化酶是一类可将尿酸氧化为尿囊素的酶,在动植物和微生物中普遍存在,但人类及猿类体内并未发现这一类酶,人体内尿酸过高常会引发高尿酸血症、痛风等相关疾病。如今痛风等疾病发病率日渐上升,尿酸氧化酶的研究也备受关注。本研究选... 详细信息

尿酸氧化酶是一类可将尿酸氧化为尿囊素的酶,在动植物和微生物中普遍存在,但人类及猿类体内并未发现这一类酶,人体内尿酸过高常会引发高尿酸血症、痛风等相关疾病。如今痛风等疾病发病率日渐上升,尿酸氧化酶的研究也备受关注。本研究选取青海省茶卡盐湖样品通过富集培养、筛选纯化等方法获得一株编号为2YHBJ-3产尿酸氧化酶的细菌。经过16S rRNA鉴定,鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)菌株。该菌株最佳发酵时间为48 h,其所产的酶活力为0.0085 U/mL,最适作用pH为6.6,最适温度为20℃;在温度为15℃~50℃及pH为5.0~8.0范围内,该酶能够保持50%相对活性;Mg2+、Fe2+能够明显提高其酶活力,Cu2+及SDS对其表现出强抑制作用。这预示着该芽孢杆菌属菌株对于尿酸氧化酶的开发利用具有一定潜在价值,为后续的医药开发提供酶力资源。

关键词：尿酸尿酸氧化酶酶学性质芽孢杆菌属