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重组人尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶2B7三个功能性突变体的构建、表达及活性比较

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中国药理学与毒理学杂志 2008年第4期22卷 274-283页

作者：袁玲敏陈静曾苏浙江大学药学院药物分析与药物代谢研究室浙江杭州310058

目的构建人尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶(UGT)2B7重组酶的3个功能性突变体UGT2B7*71S(A71S,211G>T),UGT2B7*2(H268Y,802C>T)和UGT2B7*5(D398N,1192G>A),以进一步研究该酶野生型和其突变体在对底物作用过程中的功能差异。方法应用细菌/杆状... 详细信息

目的构建人尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶(UGT)2B7重组酶的3个功能性突变体UGT2B7*71S(A71S,211G>T),UGT2B7*2(H268Y,802C>T)和UGT2B7*5(D398N,1192G>A),以进一步研究该酶野生型和其突变体在对底物作用过程中的功能差异。方法应用细菌/杆状病毒系统,将构建的pFastBac-UGT2B7*71S,pFastBac-UGT2B7*2和pFastBac-UGT2B7*5重组质粒转化*** DH10Bac大肠杆菌,通过转座作用获得各自的重组粘粒(bac-mid),然后将其转染草地夜蛾(Sf)9细胞后,产生重组杆状病毒。这些病毒再感染Sf9细胞,即可获得野生型UGT2B7*1及其突变体的重组酶。野生型及突变体酶的活性以7-羟基-4-三氟甲基香豆素(7-HFC)为底物,用荧光法测定并分析比较。结果利用杆状病毒/昆虫细胞系统,成功地构建人UGT2B7重组酶的3个功能性突变体。UGT2B7*1对7-HFC的Km值为(0.331±0.018)mmol·L-1,Vmax值为(2.14±0.04)μmol·min-1·g-1蛋白;UGT2B7*71S对7-HFC的Km值为(0.260±0.026)mmol·L-1,Vmax值为(1.36±0.05)μmol·min-1·g-1蛋白;UGT2B7*2对7-HFC的Km值为(0.53±0.06)mmol·L-1,Vmax值为(9.5±0.5)μmol·min-1·g-1蛋白;UGT2B7*5对7-HFC的Km值为(0.59±0.05)mmol·L-1,Vmax值为(7.52±0.28)μmol·min-1·g-1蛋白。结论应用细菌/杆状病毒系统,成功构建了UGT2B7的3个功能性突变体,这些突变体可进一步用于对其他底物的代谢活性比较。

关键词：尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶突变蛋白质类

瑞格非尼对人尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶活性抑制作用的体外研究

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药学学报 2017年第11期52卷 1705-1714页

作者：孙小雅葛广波唐辉王亚乔姚新成李乐石河子大学药学院新疆植物药资源利用教育部重点实验室新疆石河子832002 上海中医药大学上海201203

应用体外人肝微粒体及重组人源代谢酶孵育体系考察了瑞格非尼(regorafenib,REG)对12种人尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶(UGTs)的抑制作用,通过体外-体内外推(IV-IVE)预测REG与经过UGT1A1代谢消除药物共服引发药物-药物相互作用(DDI)的风险。... 详细信息

应用体外人肝微粒体及重组人源代谢酶孵育体系考察了瑞格非尼(regorafenib,REG)对12种人尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶(UGTs)的抑制作用,通过体外-体内外推(IV-IVE)预测REG与经过UGT1A1代谢消除药物共服引发药物-药物相互作用(DDI)的风险。以混合人肝微粒体(HLM)及重组人源UGTs作为酶源,4-甲基伞形酮(4-MU)作为UGTs的非特异性探针底物,N-(3-羧丙基)-4-羟基-1,8-萘酰亚胺(NCHN)和N-(正丁基)-4-(4-羟苯基)-1,8-萘酰亚胺(NPHN)作为UGT1A1的特异性探针底物,三氟拉嗪(TFP)作为UGT1A4的特异性探针底物,评估REG对12种人UGTs的抑制作用。通过非线性回归并拟合曲线求得半数最大抑制浓度(IC_(50)),Lineweaver-Burk和Dixon作图法确定抑制类型,二次作图法求得抑制动力学常数(K_i),并基于体外抑制动力学参数预测了REG抑制UGT1A1所引发DDI的潜在可能性。体外抑制实验表明,REG对UGT1A1、UGT1A7、UGT1A9和UGT2B7具有较强的抑制作用,IC_(50)为0.15~6.6μmol·L^(-1),K_i为0.027~14μmol·L^(-1)。REG可竞争性的抑制UGT1A1催化的4-MU-O-葡糖醛酸化反应及UGT1A1催化的NPHN-O-葡糖醛酸化反应,而非竞争性的抑制UGT1A1催化的NCHN-4-O-葡糖醛酸化反应,对UGT1A7、UGT1A9和UGT2B7催化的4-MU-O-葡糖醛酸化反应呈现混合型的抑制类型。口服治疗剂量的REG(160 mg·d^(-1))可导致UGT1A1代表性底物NPHN和NCHN的AUC分别增加101%~302%和13%~109%。结果提示,REG与主要经UGT1A1代谢的底物药物联合应用时,可通过强效抑制UGT1A1进而影响其在机体内的代谢清除,在临床使用过程中需要密切关注。

关键词：瑞格非尼尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶酶抑制药物-药物相互作用

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川芎嗪的肝微粒体代谢动力学及代谢表型研究

药学学报 2014年第3期49卷 374-379页

作者：谭妍庄笑梅沈国林李桦高月军事医学科学院毒物药物研究所北京100850 军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京100850

应用体外人和大鼠肝微粒体以及重组人源代谢酶孵育体系,研究了中药有效成分川芎嗪(TMPz)的肝代谢动力学特征和代谢酶表型。将TMPz与加入不同辅酶的人(HLM)和大鼠肝微粒体(RLM)孵育,应用LC-MS/MS法测定其剩余浓度,考察TMPz的肝微粒体代... 详细信息

应用体外人和大鼠肝微粒体以及重组人源代谢酶孵育体系,研究了中药有效成分川芎嗪(TMPz)的肝代谢动力学特征和代谢酶表型。将TMPz与加入不同辅酶的人(HLM)和大鼠肝微粒体(RLM)孵育,应用LC-MS/MS法测定其剩余浓度,考察TMPz的肝微粒体代谢稳定性和酶动力学。在+NADPH和+NADPH+UDPGA的肝微粒体中,TMPz发生代谢转化。在同时加入NADPH和UDPGA的HLM和RLM中,TMPz的t1/2、Km和Vmax分别为(94.24±4.53)和(105.07±9.44)min、(22.74±1.89)和(33.09±2.74)μmol·L-1、以及(253.50±10.06)和(190.40±8.35)nmol·min-1·mg-1(protein)。TMPz在HLM的代谢消除略快于RLM,其氧化生成活性产物2-羟甲基-3,5,6-三甲基吡嗪(HTMP)后可进一步与葡糖醛酸结合。应用重组人源CYP酶及特异化学抑制剂法确定CYP1A2、2C9和3A4是参与川芎嗪Ⅰ相代谢的CYP同工酶,并介导了HTMP的生成。经整体归一化法得到CYP1A2、2C9和3A4的贡献率分别是19.32%、27.79%和52.90%。应用LC-MS/MS峰面积相对定量法,观察到UGT1A1、1A4和1A6是介导HTMP葡糖醛酸结合反应的主要尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶(UGT)亚型。上述结果表明,川芎嗪的肝脏代谢涉及多酶介导的Ⅰ相和Ⅱ相代谢。

关键词：川芎嗪细胞色素P450酶尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶药物-药物相互作用

大鼠肝纤维化状态下肝脏和小肠药物代谢功能的改变

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大鼠肝纤维化状态下肝脏和小肠药物代谢功能的改变

作者：胡小玲武汉大学

学位级别：硕士

药物作为外源性物质在体内发生化学结构的改变称为生物转化。体内能够使药物发生生物转化的器官主要是肝脏，其次是小肠。生物转化过程分为两个时相：Ⅰ相包括氧化、还原和水解反应，使药物分子结构中引入或暴露出极性集团，如产生羟基... 详细信息

药物作为外源性物质在体内发生化学结构的改变称为生物转化。体内能够使药物发生生物转化的器官主要是肝脏，其次是小肠。生物转化过程分为两个时相：Ⅰ相包括氧化、还原和水解反应，使药物分子结构中引入或暴露出极性集团，如产生羟基、羧基、巯基、氨基等;Ⅱ相为结合反应，是药物分子结构中的极性基团与体内的化学成分如葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽等经共价键结合，生成易溶于水且极性高的代谢物，最终排出体外。药物的生物转化是在酶的催化下进行的。细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)1-3家族是最主要的Ⅰ相代谢酶;尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶(uridine diphosphate-glucuronate transferase，UGT)、谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)是Ⅱ相结合反应的主要酶。药物代谢Ⅰ相和Ⅱ相酶均具有个体差异大、易受诱导或抑制等特点。研究疾病状态下参与药物代谢的CYP亚型改变，可以预测药物的治疗功效和相互作用，从而指导临床用药;对疾病状态下参与某些前致癌物和前致毒物代谢活化过程的CYP亚型和参与某些致癌物和毒物结合反应过程的UGT、GST的研究，对减轻肝肠毒性、防治肿瘤等具有重要的临床意义。本论文研究了肝纤维化状态下肝脏和小肠药物代谢功能的改变：建立大鼠急性肝损伤、肝纤维和肝硬化模型。以血清谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transarninase，GPT)、谷草转氨酶(glutamic pyruvic transaminase，GOT)、肝脏羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)及肝组织病理学为诊断指标，建立大鼠四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl)急性肝损伤模型和复合因素(CCl+高脂低蛋白饲料+乙醇)肝纤维、肝硬化模型。结果显示，急性肝损伤时，大鼠血清GPT、GOT活性升高，分别为正常对照组的12.7和4.8倍(P＜0.01)，肝细胞轻度肿胀，胞浆内见小而圆的脂肪空泡，单个细胞核固缩，并见肝细胞点状坏死;肝纤维化时，血清GPT、GOT活性进一步升高，肝脏Hyp含量明显增加，分别为正常对照组的16.7、5.2、1.9倍(P＜0.01，P＜0.05)，肝细胞显著脂肪变，门管区纤维组织索状增生，部分伸入肝小叶;肝硬化时一，血清GPT， GOT活性和肝脏H}rP含量较肝纤维化时进一步升高，分别为正常对照组的18.9、7.7、 2.7倍(P酶、肝胞浆抗氧化酶活性变化，并与急性肝损伤、肝硬化大鼠肝脏相关指标进行比较。结果显示:肝纤维化时，大鼠肝微粒体药物代谢I相酶一CYp总量、CYplAI(7一ethoxyresorufino一deethylase， EROD)、CYPZEI(aniline hydroxylase，ANH)、CYP3A(erythromyein N-demethylase，ERI)) 活性和n相酶一GST活性均明显降低，分别为正常对照组的41%、68%、56%、81% 和59%(尸0.05)，其余指标较肝纤维化时进一步降低，分别为正常对照组的33%、64%、71%和43%(尸酶一GST、谷肤甘肤过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH一px)、过氧化氢酶(eatalase， Cat)活性均降低(p酶(s即eroxide dismutase，SOD)活性均无变化(P酶一 CYP3A·CYPIAI、CYPZEI、UGT、a一GST、二一GST活性变化，脂质过氧化物丙二醛 (malondialdehyde，MDA)含量变化，抗氧化酶一SOD、GSH一PX、Cat活性及膜流动性一荧光偏振

关键词：细胞色素P450 尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶谷肤甘肤S-转移酶肝纤维化小肠药物代谢酶抗氧化酶系统膜流动性

橙皮素及柚皮素对UGTs活性影响及其临床药物相互作用风险预测

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橙皮素及柚皮素对UGTs活性影响及其临床药物相互作用风险预测

作者：刘丹南昌大学

学位级别：硕士

背景:橙皮素、柚皮素分别为黄烷酮类化合物橙皮苷、柚皮苷的苷元,来源丰富,广泛存在于芸香科植物中,在柑橘、柚子等水果中含量颇高,且为传统中药枳实、枳壳中的重要有效成分。研究表明,橙皮素、柚皮素具有促进胃肠蠕动、解痉、抗炎症、... 详细信息

背景:橙皮素、柚皮素分别为黄烷酮类化合物橙皮苷、柚皮苷的苷元,来源丰富,广泛存在于芸香科植物中,在柑橘、柚子等水果中含量颇高,且为传统中药枳实、枳壳中的重要有效成分。研究表明,橙皮素、柚皮素具有促进胃肠蠕动、解痉、抗炎症、抗氧化、抗肿瘤、保护心血管和调节血糖等药效作用。已有研究表明橙皮素、柚皮素可抑制CYP450s活性,但是否影响UGTs的活性未见研究报道,是否会产生基于UGTs介导的临床药物相互作用,值得深入探讨,为指导临床合理用药提供理论与实验依据。目的:以重组表达的人UGTs作为酶源,选用4-甲基伞形酮(4-MU)为11种UGTs酶的广谱探针底物,三氟拉嗪(TFP)为UGT1A4的特异性探针底物,系统研究探讨橙皮素、柚皮素对12种尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)活性的影响,并通过体外-体内推导法预测发生药物间相互作用的风险,为临床合理用药提供理论与实验依据。方法:1、橙皮素、柚皮素对UGTs抑制作用的初步筛选将低、中、高浓度(1,10,100μM)橙皮素、柚皮素分别加入含12种UGTs的孵育体系中,测定4-MUG/TFP-G浓度,计算酶剩余活性,初步评价橙皮素、柚皮素对12种UGTs酶亚型的影响。2、橙皮素、柚皮素对UGTs酶动力学影响机制分析根据初步评价结果,选择系列浓度的橙皮素、柚皮素分别加入至有影响的UGTs酶体系中,计算酶剩余活性,并用软件Prism 5计算IC值。根据IC50酶动力学参数Ki值。3、临床药物间相互作用的风险预测根据文献中人体摄入橙皮素、柚皮素的清除率,Cmax以及橙皮素、柚皮素在体内的解离常数和UGTs酶抑制动力学参数Ki值等数据,计算出[I]in vivo/Ki,并根据[I]/Ki>1高风险;0.1酶剩余活性均小于50%。(2)柚皮素在终浓度为100μM时,UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A7、UGT1A8、UGT1A9、UGT1A10、UGT2B7、UGT2B15的酶剩余活性均小于50%。2、橙皮素、柚皮素对UGTs酶动力学影响机制分析(1)橙皮素对UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A7、UGT1A8、UGT1A9、UGT2B4抑制作用的IC50值分别为4.72±0.52μM,9.19±0.37μM,63.87±3.67μM,29.68±1.87μM,74.75±4.73μM,3.94±0.17μM,32.73±1.67μM。根据IC50糖醛酸化反应,其Ki值分别为9.63±0.87μM,0.99±0.08μM,3.41±0.35μM。(2)柚皮素对UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A7、UGT1A8、UGT1A9、UGT1A10、UGT2B7、UGT2B15抑制作用的IC50值分别为8.577±0.65μM,10.85±0.37μM,55.21±1.54μM,31.91±1.87μM,26.77±0.56μM,15.34±0.39μM,38.35±1.05μM,3.47±0.52μM,32.51±2.03μM。根据IC50糖醛酸化反应;柚皮素可非竞争性抑制UGT1A1、反竞争性抑制UGT1A3、竞争性抑制UGT2B7介导的葡萄糖醛酸化反应。2、通过体外-体内推导预测,橙皮素、柚皮素可分别抑制UGT1A3、UGT2B7的活性,与经过UGT1A3、UGT2B7代谢的临床药物发生相互作用的风险较强,临床联合用药

关键词：橙皮素柚皮素尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶中草药-药物相互作用