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小檗碱通过抑制脂肪酸摄取降低小鼠原代肝细胞脂质沉积

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中国药理学通报 2018年第3期34卷 337-342页

作者：俞牧雨米日阿依·阿里木江刘威殷峻上海交通大学附属第六人民医院内分泌代谢科、上海市糖尿病研究所、上海市糖尿病重点实验室、上海市糖尿病临床医学中心、上海市代谢病临床医学中心上海200233 上海交通大学附属第六人民医院骨科上海200233

目的观察小檗碱对小鼠原代肝细胞脂质沉积的影响及其是否依赖于磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)通路,探讨小檗碱治疗非酒精性脂肪肝的作用机制。方法用不同浓度白蛋白偶联的油酸(OA)... 详细信息

目的观察小檗碱对小鼠原代肝细胞脂质沉积的影响及其是否依赖于磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)通路,探讨小檗碱治疗非酒精性脂肪肝的作用机制。方法用不同浓度白蛋白偶联的油酸(OA)孵育小鼠原代肝细胞,确定OA诱导脂肪变的具体浓度,同时以二甲双胍为阳性对照,给予小檗碱处理24 h,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测确定小檗碱的安全剂量;油红染色定性判断细胞内脂质水平;酶法定量检测细胞内甘油三酯含量;Western blot法检测AMPK以及乙酰辅酶A羧化酶(ACC)磷酸化水平。AMPK的特异性阻断剂Compound C(CC)孵育原代肝细胞1 h后,再用小檗碱处理细胞24 h,油红染色及甘油三酯检测判断AMPK被抑制时小檗碱对脂质沉积的作用。生化分析仪检测OA组、小檗碱组、鱼藤酮(线粒体复合物I抑制剂)组细胞上清液中脂肪酸的含量,观察细胞对脂肪酸的摄取情况与复合物I抑制之间的关系。结果小檗碱在无细胞毒性的剂量下可明显降低小鼠原代肝细胞中油酸所致脂质沉积。同时,小檗碱可使AMPK及ACC的磷酸化水平增加。此外,在加入CC即AMPK活性被抑制的情况下,小檗碱降低肝细胞脂质沉积的作用不受影响。小檗碱和鱼藤酮分别使肝细胞的油酸摄取减少约31.2%和23.6%。结论小檗碱通过抑制电子传递链线粒体复合物I抑制脂肪酸摄取,进而降低小鼠原代肝细胞脂质沉积,这一作用并不依赖于AMPK通路。

关键词：小檗碱脂肪酸摄取小鼠原代肝细胞脂质沉积电子传递链复合物I 磷酸腺苷活化蛋白激酶

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改良的小鼠原代肝细胞分离纯化方法

南京医科大学学报（自然科学版） 2008年第11期28卷 1437-1440页

作者：余莹张日华朱自强王林涛南京医科大学生物化学与分子生物学系江苏南京210029 南京医科大学第一附属医院老年科江苏南京210029

目的:建立一种简便、经济、高效的小鼠肝细胞分离和纯化方法。方法:对传统的两步原位胶原酶灌流法进行改进,缩短消化时间和改变灌注方式;分离的小鼠肝细胞,采用低速离心(300 r/min,1min,3～5次)纯化,台盼兰染色检测活率,糖原染色鉴定肝... 详细信息

目的:建立一种简便、经济、高效的小鼠肝细胞分离和纯化方法。方法:对传统的两步原位胶原酶灌流法进行改进,缩短消化时间和改变灌注方式;分离的小鼠肝细胞,采用低速离心(300 r/min,1min,3～5次)纯化,台盼兰染色检测活率,糖原染色鉴定肝细胞,并与单密度梯度离心纯化法进行比较。结果:原代肝细胞经低速离心纯化后,活率达到90%左右,纯度达95%以上,与密度梯度离心法效果相近。结论:建立了一种新的小鼠原代肝细胞的分离纯化方法。

关键词：小鼠原代肝细胞原代培养 Ⅳ型胶原酶

小鼠原代肝细胞中PTEN基因沉默所需siRNA的筛选

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中国当代医药 2019年第8期26卷 22-24,28页

作者：周龙王立林胡序怀深圳市卫生健康发展研究中心广东深圳518000 南方医科大学附属深圳妇幼保健院麻醉科广东深圳518000 深圳市血液中心广东深圳518000

目的筛选出小鼠原代肝细胞中PTEN基因沉默所需的高效siRNA。方法采用两步胶原酶灌注法分离小鼠原代肝细胞,放入25 cm^2胶原包被瓶中(1×106个/瓶),均分为5组:对照组(C组)、阴性对照组(NC组)、siR-996组、siR-1381组、siR-1519组。采用Hi... 详细信息

目的筛选出小鼠原代肝细胞中PTEN基因沉默所需的高效siRNA。方法采用两步胶原酶灌注法分离小鼠原代肝细胞,放入25 cm^2胶原包被瓶中(1×106个/瓶),均分为5组:对照组(C组)、阴性对照组(NC组)、siR-996组、siR-1381组、siR-1519组。采用Hi PerFect转染试剂将各组对应的siRNA序列转入小鼠原代肝细胞,24 h后提取RNA和蛋白,通过Real-time PCR检测各组PTEN mRNA表达,通过Western blot检测各组PTEN蛋白含量。结果siR-996组、siR-1381组和siR-1519组的PTEN蛋白含量低于NC组,差异有统计学意义(P小鼠原代肝细胞中PTEN基因沉默所需的高效siRNA。

关键词：小鼠原代肝细胞 PTEN磷酸水解酶小干扰RNA 胰岛素抵抗

炎症因子上调SREBP-1致小鼠原代肝细胞脂质异常聚集及损伤

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炎症因子上调SREBP-1致小鼠原代肝细胞脂质异常聚集及损伤

作者：柏灵灵重庆医科大学

学位级别：硕士

第一部分小鼠原代肝细胞的分离与培养目的：肝脏是脂质代谢的重要器官，建立小鼠原代肝细胞的体外培养技术，用于后续脂代谢研究。方法：采用IV型胶原酶原位二步灌流法分离小鼠原代肝细胞。用台盼蓝试剂对新鲜分离的细胞进行染色以检测... 详细信息

第一部分小鼠原代肝细胞的分离与培养目的：肝脏是脂质代谢的重要器官，建立小鼠原代肝细胞的体外培养技术，用于后续脂代谢研究。方法：采用IV型胶原酶原位二步灌流法分离小鼠原代肝细胞。用台盼蓝试剂对新鲜分离的细胞进行染色以检测细胞活率，并在不同时间点观察细胞贴壁情况和培养基中白蛋白的分泌情况。通过对肝细胞白蛋白进行免疫细胞化学染色和糖原染色，完成对肝细胞的鉴定。结果：台盼蓝结果显示:本法所制得的小鼠原代肝细胞活率最高可达90%。刚分离的肝细胞大多数呈单个球形，具有一定立体感。4小时后肝细胞已基本贴壁，可见肝细胞的典型的双核结构，胞质呈扁平状。1天后双核更加明显，核仁清晰可见，胞质贴壁更加扁平，2天后细胞成多边形，并维持此形态数天。免疫细胞化学染色和糖原染色显示，所培养细胞基本均可合成白蛋白和糖原，并且一周以内都可以在培养基中检测到细胞分泌的白蛋白。结论：小鼠原代肝细胞的分离与培养技术建立成功，在一周内具有较好的形态和功能，可进行后续实验。第二部分炎症因子对小鼠原代肝细胞脂质积聚及损伤的影响目的：近年来的研究发现，慢性系统性炎症在代谢性疾病的发生和发展中有十分重要的作用。我们通过建立原代肝细胞分离与培养技术，在体外模拟肝细胞正常生理状态，探讨炎症因子是否能造成小鼠原代肝细胞脂质的聚集及损害。方法：将培养的小鼠原代肝细胞分为以下6个组: Control组、软脂酸组（PA）组、炎症因子TNF-α组和IL-6组、PA+TNF-α组和PA+IL-6组。定量检测细胞内甘油三酯和游离脂肪酸水平及油红O染色法来观察各组细胞的脂质沉积情况。荧光定量PCR法检测内质网应激指标IRE1, ATF6, GRP78水平。通过测定过氧化氢以及活性氧水平来检测细胞的氧化应激状态。结果：给予炎症因子TNF-α或IL-6炎症刺激后，小鼠原代肝细胞的甘油三酯的含量出现了明显升高;即使在高脂肪酸背景下，炎症因子同样也能刺激脂肪酸和甘油三酯的含量。这与肝细胞的油红O染色结果一致。进一步检测发现，内质网应激指标IRE1,ATF6, GRP78的基因表达水平以及氧化应激指标ROS和H2O2水平与脂肪酸和甘油三酯含量变化趋势基本一致。结论：炎症因子可使脂质在小鼠原代肝细胞内异常积聚，进而还可引起氧化应激和内质网应激而使肝细胞受损。第三部分炎症因子对SREBP-1及其下游靶基因表达的影响目的：SREBP-1是一种在肝脏中含量丰富的核转录因子，主要通过调控下游靶基因ACCα和FAS的表达，进而调节脂肪酸的合成，影响肝脏内甘油三酯的含量。本研究旨在探讨炎症因子对SREBP-1、ACCα和FAS表达的影响。方法：按第二部分的方法对原代肝细胞进行分组。采用荧光定量PCR法检测炎症因子对小鼠原代肝细胞中SREBP-1、ACCα和FAS基因水平变化，同时采用蛋白免疫印迹（Western Blotting）的方法观察炎症因子对小鼠原代细胞中SREBP-1、ACCα和FAS蛋白表达情况。结果：给予炎症因子TNF-α或IL-6炎症刺激后，小鼠原代肝细胞的SREBP-1，FAS和ACCα的基因和蛋白表达出现了明显升高;即使在高脂肪酸背景下，炎症因子同样也能刺激SREBP-1，FAS和ACCα的基因和蛋白表达。结论：炎症因子可以刺激SREBP-1、ACCα和FAS的表达增加。

关键词：原代肝细胞分离胶原酶炎症因子小鼠原代肝细胞脂质氧化应激内质网应激炎症因子 SREBP-1 ACCα FAS

锌alpha2糖蛋白对棕榈酸诱导的C57小鼠原代肝细胞内脂质代谢的影响及机制

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锌alpha2糖蛋白对棕榈酸诱导的C57小鼠原代肝细胞内脂质代谢的影...

作者：王亚荻南华大学

学位级别：硕士

目的:探讨锌alpha2糖蛋白(Zinc alpha2 glycoprotein,ZAG)对棕榈酸诱导的小鼠原代肝细胞内脂质代谢的影响及机制。方法:1.分离及培养小鼠原代肝细胞。2.0.4mM棕榈酸干预小鼠原代肝细胞24h后,用重组2型腺相关病毒(rAAV2-ZAG)及空病毒感染... 详细信息

目的:探讨锌alpha2糖蛋白(Zinc alpha2 glycoprotein,ZAG)对棕榈酸诱导的小鼠原代肝细胞内脂质代谢的影响及机制。方法:1.分离及培养小鼠原代肝细胞。2.0.4mM棕榈酸干预小鼠原代肝细胞24h后,用重组2型腺相关病毒(rAAV2-ZAG)及空病毒感染48h,采用酶联免疫法检测细胞内甘油三酯的水平,油红O染色观察细胞内脂滴,检测肝脏代谢性核受体、脂肪酸合成及分解相关基因、脂联素等的表达。3.用0.4mM PA干预24h,予以换液移除PA,再用浓度为1mM的ETO干预细胞8h,再次予以换液后加入ZAG重组蛋白处理24h,检测细胞内β-羟丁酸和甘油三酯的水平。结果:1.成功分离及培养出小鼠原代肝细胞。2.油红O染色显示,PA处理后过表达ZAG组小鼠原代肝细胞内被染成红色的脂滴数量明显减少;细胞内甘油三酯测定显示,过表达ZAG组的小鼠原代肝细胞内TG含量降低。3.在棕榈酸干预下,与r AAV2-GFP组相比,rAAV2-ZAG组ZAG、脂联素、FXR、PPARα、CPT1A表达增加(P细胞内TG水平显著降低(下降了52.3%,P细胞内TG水平稍降低(下降了10.7%,P小鼠原代肝细胞内TG沉积。

关键词：锌alpha2糖蛋白小鼠原代肝细胞肝脏代谢性核受体

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环丙沙星对小鼠原代肝细胞自噬的研究

环丙沙星对小鼠原代肝细胞自噬的研究

作者：周萍成都学院

学位级别：硕士

背景:研究发现自噬在治疗多种疾病中起着重要的作用,环丙沙星是亲溶酶体抗生素,溶酶体是自噬过程中的关键细胞器,环丙沙星可能通过干扰细胞自噬活性而影响肝细胞的生理或病理功能。目的:检测环丙沙星自噬活性,筛选出环丙沙星给药小鼠原... 详细信息

背景:研究发现自噬在治疗多种疾病中起着重要的作用,环丙沙星是亲溶酶体抗生素,溶酶体是自噬过程中的关键细胞器,环丙沙星可能通过干扰细胞自噬活性而影响肝细胞的生理或病理功能。目的:检测环丙沙星自噬活性,筛选出环丙沙星给药小鼠原代肝细胞的差异表达基因,富集环丙沙星小鼠功能基因以及信号通路,为进一步揭示环丙沙星给药后的体内代谢及分子机制研究提供理论依据。方法:17.0±2.0g昆明小鼠,饲养于SPF系统中,按照随机原则,分为实验组和对照组,实验组小鼠采用灌胃方式给环丙沙星,对照组予生理盐水,持续7天,于第7天通过胶原酶灌注法分离小鼠原代肝细胞,贴壁后换液,自噬溶酶体荧光探针试剂盒按照比例加入,拍摄荧光图片,Agilent小鼠全基因组表达谱芯片检测基因表达。结果:实验组及对照组都可见自噬荧光亮点,但实验组亮点较小且数量更少。按照Foldchange≥1.5或≤0.75,组间进行t-test分析,检验标准P小鼠原代肝细胞自噬活性被环丙沙星抑制,通过生物信息学分析发现环丙沙星可以显著影响小鼠肝脏基因表达,差异基因富集主要集中在信号传导、糖代谢等。根据实验获得的信号通路,我们将在后期实验,进一步验证环丙沙星影响小鼠原代肝细胞自噬活性的主要信号通路以及证实差异基因之间的相互作用。

关键词：自噬环丙沙星小鼠原代肝细胞基因芯片

胰蛋白酶和胶原酶灌注法分离提取小鼠原代肝细胞的比较

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汕头大学医学院学报 2022年第4期35卷 204-209页

作者：任文洁林哲绚汕头大学医学院生物分析实验室广东汕头515041

目的:胰蛋白酶和胶原酶灌注法分离提取小鼠原代肝细胞的比较。方法:改良Seglen两步灌注法,选用胰蛋白酶和胶原酶D分别对同批生长的10~16周C57BL/6J雄性小鼠进行在体灌注分离肝实质细胞,比较分离肝细胞的存活率、纯度、形态、活性、获取... 详细信息

目的:胰蛋白酶和胶原酶灌注法分离提取小鼠原代肝细胞的比较。方法:改良Seglen两步灌注法,选用胰蛋白酶和胶原酶D分别对同批生长的10~16周C57BL/6J雄性小鼠进行在体灌注分离肝实质细胞,比较分离肝细胞的存活率、纯度、形态、活性、获取数量等。结果:两种方法分离得到的小鼠原代肝细胞的存活率和纯度均达到90%以上,且在形态学上无明显差异,不同培养时间的细胞活性基本一致。胶原酶灌注法所得到的细胞数量多于胰蛋白酶灌注法。结论:胰蛋白酶和胶原酶灌注法均适用于分离提取小鼠原代肝细胞,可根据实验条件选择不同的灌注方法。

关键词：酶灌注法小鼠原代肝细胞胰蛋白酶胶原酶

PTEN基因沉默对小鼠原代肝细胞Akt/GSK-3β信号通路的影响

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重庆医学 2019年第7期48卷 1107-1109页

作者：周龙王立林胡序怀李亚文广东省深圳市卫生健康发展研究中心 518000 南方医科大学附属深圳妇幼保健院麻醉科广东深圳518000 广东省深圳市血液中心 518000

目的探讨第10号染色体缺失性磷酸酶-张力蛋白同源物蛋白(PTEN)对小鼠原代肝细胞蛋白激酶B/糖原合酶激酶-3β(Akt/GSK-3β)信号通路的影响。方法采用两步胶原酶灌注法分离小鼠原代肝细胞,均分为4组:阴性对照组(NC-C组)、阴性对照白细胞介... 详细信息

目的探讨第10号染色体缺失性磷酸酶-张力蛋白同源物蛋白(PTEN)对小鼠原代肝细胞蛋白激酶B/糖原合酶激酶-3β(Akt/GSK-3β)信号通路的影响。方法采用两步胶原酶灌注法分离小鼠原代肝细胞,均分为4组:阴性对照组(NC-C组)、阴性对照白细胞介素-6(IL-6)组(NC-IL组)、siR-996对照组(996-C组)、siR-996与IL-6组(996-IL组)。采用HiPerFect转染试剂将siRNA-996转入小鼠原代肝细胞,24h后提取蛋白,通过蛋白质印迹法(Western blot)检测各组Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、GSK-3β、磷酸化GSK-3β(pGSK-3β)、PTEN蛋白水平。结果在PTEN蛋白水平上,与NC-C组相比,NC-IL组升高(P小鼠原代肝细胞Akt/GSK-3β信号通路的抑制,增强小鼠原代肝细胞Akt/GSK-3β信号通路的表达。

关键词： PTEN磷酸水解酶小鼠原代肝细胞 RNA干扰蛋白激酶B 糖原合成酶激酶-3β

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丙泊酚对小鼠原代肝细胞PTEN表达的影响

中国现代医生 2019年第3期57卷 30-33页

作者：周龙王立林李亚文胡序怀深圳市卫生健康发展研究中心广东深圳518000 南方医科大学附属深圳妇幼保健院麻醉科广东深圳518000 深圳市血液中心广东深圳518000

目的探讨丙泊酚对小鼠原代肝细胞PTEN表达的影响。方法采用两步胶原酶灌注法分离小鼠原代肝细胞,均分为三组:对照组(C组)、溶剂对照组(D组)、丙泊酚组(P组)。首先用MTT法检测不同培养浓度[(1～100)μg/mL]下丙泊酚对小鼠原代肝细胞活性... 详细信息

目的探讨丙泊酚对小鼠原代肝细胞PTEN表达的影响。方法采用两步胶原酶灌注法分离小鼠原代肝细胞,均分为三组:对照组(C组)、溶剂对照组(D组)、丙泊酚组(P组)。首先用MTT法检测不同培养浓度[(1～100)μg/mL]下丙泊酚对小鼠原代肝细胞活性的影响,接着选取10μg/mL的丙泊酚(终浓度)作为培养条件,用MTT法检测不同培养时间[(1～32)h]下小鼠原代肝细胞活力变化。P组选用10μg/mL的丙泊酚(终浓度)处理小鼠原代肝细胞24 h。用Real-time PCR检测各组PTEN mRNA表达,用Western blot检测各组PTEN蛋白含量。结果在所有检测项目上,C组与D组的差异均无统计学意义(P>0.05)。与C组相比,丙泊酚浓度为1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL时小鼠原代肝细胞活性的差异无统计学意义(P>0.05),丙泊酚浓度为100μg/mL时小鼠原代肝细胞活性显著降低(P小鼠原代肝细胞活性的差异无统计学意义(P>0.05)。P组PTEN蛋白含量显著高于D组(P小鼠原代肝细胞PTEN表达增强。

关键词：二异丙酚小鼠原代肝细胞 PTEN磷酸水解酶胰岛素抵抗