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作者：许博然内蒙古农业大学

学位级别：硕士

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是参与天然免疫的一类重要的模式识别受体,在天然免疫和获得性免疫反应过程中发挥着重要的作用。当细菌及其毒素等模式识别分子与TLRs结合进而激活TLRs,诱导趋化因子、细胞因子以及炎症介质的大量... 详细信息

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是参与天然免疫的一类重要的模式识别受体,在天然免疫和获得性免疫反应过程中发挥着重要的作用。当细菌及其毒素等模式识别分子与TLRs结合进而激活TLRs,诱导趋化因子、细胞因子以及炎症介质的大量分泌并促进炎症细胞的浸润,引发炎症反应的发生。研究发现,在抗细菌感染所引发的炎症过程中TLR2和TLR4发挥着核心作用,如能够控制TLR2和TLR4的激活效应,则能够控制细菌感染过程中过度炎症反应的发生。因此,本研究根据文献已公布序列,合成了 TLR2和TLR4的特异性封闭肽。采用荧光定量PCR、ELISA以及Western Blot等技术检测了 TLR2和TLR4的特异性封闭肽对小鼠腹腔巨噬细胞细胞因子IL-1β、IL-10、TNF-α以及RANTES表达和ERK、p38、JNK以及p65磷酸化的影响。TLR2和TLR4封闭肽预处理(24h)的小鼠腹腔巨噬细胞在LPS刺激4h后,荧光定量PCR检测结果显示,与LPS刺激组相比较,CP对照组IL-1β、IL-10、TNF-α以及RANTESmRNA的相对表达量无显著性差异(P>0.05),TLR2和TLR4封闭肽作用组IL-1β、TNF-α、IL-10以及RANTES mRNA的相对表达量极显著性降低(P封闭肽对促炎性细胞因子(IL-1β和TNF-α)、抗炎性细胞因子(IL-10)以及趋化因子(RANTES)基因的表达存在抑制效果。ELISA检测结果显示,与LPS刺激组相比较CP对照组IL-1β、IL-10、TNF-α以及RANTES蛋白的表达量无显著性差异(P＞0.05),TLR2和TLR4封闭肽作用组IL-1β、TNF-α、IL-10以及RANTES蛋白的表达量极显著性降低(P封闭肽对促炎性细胞因子(IL-1β和TNF-α)、抗炎性细胞因子(IL-10)以及趋化因子(RANTES)蛋白的表达存在抑制效果。Western Blot检测结果显示,无论TLR2封闭肽还是TLR4封闭肽均可以明显的抑制p65和ERK的激活,且TLR4封闭肽的效果优于TLR2封闭肽;TLR2封闭肽对p38与JNK的激活缺乏明显抑制效果,TLR4封闭肽抑制p38与JNK的激活效果较为明显,以上说明封闭肽对LPS激活的NF-κB以及MAPK信号通路的转导具有一定的抑制效果。综上所述,TLR2和TLR4封闭肽能够通过抑制NF-κB和MAPK信号转导通路的激活,进而对小鼠腹腔巨噬细胞合成与分泌促炎性细胞因子(IL-1β和TNF-α)、抗炎。性细胞因子(IL-10)和趋化因子(RANTES)产生抑制效应,为日后将TLR2和TLR4封闭肽作为生物制剂应用于兽医临床治疗细菌性感染疾病奠定了理论依据。

关键词： TLR2 TLR4 封闭肽巨噬细胞炎症因子

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TIR结构域来源封闭肽对LPS诱导小鼠乳腺炎的保护作用机制

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作者：胡晓宇吉林大学

学位级别：硕士

奶牛乳腺炎是造成奶牛养殖业重大经济损失的主要疾病之一,大肠杆菌等革兰氏阴性菌感染乳腺组织导致的剧烈炎症反应引起的免疫损伤是奶牛乳腺炎发生的主要原因。脂多糖(LPS)是大肠杆菌诱发机体剧烈炎症反应的主要毒力因子,乳导管单独灌注... 详细信息

奶牛乳腺炎是造成奶牛养殖业重大经济损失的主要疾病之一,大肠杆菌等革兰氏阴性菌感染乳腺组织导致的剧烈炎症反应引起的免疫损伤是奶牛乳腺炎发生的主要原因。脂多糖(LPS)是大肠杆菌诱发机体剧烈炎症反应的主要毒力因子,乳导管单独灌注LPS可引起与大肠杆菌感染完全相同的临床症状。研究发现LPS引起的剧烈炎症反应是由宿主天然免疫系统中的TLR4识别并向下游转导信号,引起相关通路终点核转录因子入核,控制细胞因子基因表达的结果。TLR4及其下游衔接分子都存在TIR结构域,衔接蛋白分子通过彼此之间的TIR结构域相互作用,保证通路蛋白分子正常衔接,使得信号通路正常转导,本课题通过模拟衔接分子TIR结构域的空间构象合成可干扰TIR-TIR相互作用的封闭肽,借以阻断TLR4信号通路的正常转导,用于控制机体的炎症反应。本实验将已经合成并且筛选出来的具有抗炎作用的封闭肽TM6和TR6用于研究其对LPS诱导的小鼠乳腺炎的保护作用及保护机制。首先通过LPS乳导管灌注的方法建立小鼠乳腺炎动物模型,并且分别给予不同浓度的预先筛选出的具有抗炎作用的封闭肽TM6或TR6。LPS刺激24小时之后收集乳腺组织样品,通过H&E方法检测乳腺组织的病理学变化;通过ELISA方法检测乳腺组织炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达情况;通过MPO试剂盒检测乳腺组织MPO活性变化评价TM6或TR6对LPS诱导的小鼠乳腺炎的保护作用。实验结果表明,与对照组相比,LPS刺激的小鼠乳腺组织发生明显的病理学变化,如腺泡形态发生改变、炎性细胞因子浸润、充血等现象,此外乳腺组织炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MPO活性也明显升高,然而不同剂量的TM6或TR6抑制了LPS诱导的乳腺组织炎性变化,并且呈剂量依赖性,以上的结果表明,在LPS诱导的小鼠乳腺炎动物模型中,封闭肽TM6或TR6对乳腺炎症具有保护作用。为了进一步研究封闭肽对LPS诱导的小鼠乳腺炎保护作用的机制,我们通过酶消化法提取小鼠的乳腺上皮细胞用于下一步实验。首先通过MTT法检测TM6或TR6在所用剂量0-20μM范围内对乳腺上皮细胞没有细胞毒性作用,之后以1μg/ml的LPS刺激乳腺上皮细胞,并且用不同浓度的TM6或TR6预处理1小时,收集样品,通过ELISA方法检测炎性细胞因子的表达;通过western blot方法检测NF-κB和MAPK信号通路的表达。实验结果表明,不同浓度的TM6或TR6明显的抑制了LPS刺激小鼠乳腺上皮细胞引起的炎性细胞因子TNF-α和IL-6的表达,并且TM6或TR6能够进一步抑制NF-κB和MAPK信号通路相关蛋白的表达。以上实验结果表明,封闭肽TM6或TR6可能是通过抑制NF-κB和MAPK信号通路的活化进而抑制炎性细胞因子的表达,从而对乳腺炎起到保护性的作用。综上所述,本研究首先通过LPS诱导的小鼠乳腺炎动物模型证明封闭肽TM6或TR6对乳腺组织的损伤具有保护性作用,为了进一步研究TM6或TR6对乳腺组织损伤的保护作用机制,我们通过体外培养的乳腺上皮细胞为实验工具,进一步表明了封闭肽TM6或TR6可能是通过抑制LPS诱导的NF-κB和MAPK信号通路的活化抑制炎性细胞因子的表达,进而对LPS诱导的乳腺炎起到保护作用。这些结果表明针对先天性免疫信号通路TLR4及相关衔接蛋白合成不同的封闭肽抑制炎性信号的正常转导,可能成为未来新抗炎制剂开发的方向。

关键词：乳腺炎脂多糖封闭肽细胞因子 NF-κB MAPK

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TNFR1BP/IgGFc融合蛋白载体的构建、表达及其生物学活性研究

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华中科技大学学报（医学版） 2008年第5期37卷 561-564,F0002页

作者：黄丽霞尹丙姣王晶梁慧芳曾庆岭姜小丹李卓娅华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系武汉430030

目的构建肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)封闭肽与IgGFc融合蛋白的真核表达载体,检测其表达和生物学活性。方法将合成的TNFR1封闭肽(TNFR1BP)基因片段插入质粒pIG/3C,构建真核表达载体pIG/3C-TNFR1BP;脂质体法将重组载体转染COS-7细胞;ELISA和... 详细信息

目的构建肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)封闭肽与IgGFc融合蛋白的真核表达载体,检测其表达和生物学活性。方法将合成的TNFR1封闭肽(TNFR1BP)基因片段插入质粒pIG/3C,构建真核表达载体pIG/3C-TNFR1BP;脂质体法将重组载体转染COS-7细胞;ELISA和Western blot法检测转染细胞的培养上清中TNFR1BP/IgGFc融合蛋白的表达;间接免疫荧光抑制实验、细胞毒抑制实验检测融合蛋白对TNFR1的封闭作用。结果经PCR和核苷酸序列测定证实TNFR1BP基因正确插入质粒pIG/3C。ELISA检测证实,在转染细胞培养上清中有融合蛋白的表达;间接免疫荧光抑制实验和细胞毒抑制实验证实融合蛋白能结合L929细胞表面的TNFR1,并能抑制分泌型肿瘤坏死因子α(sTNF-α)介导的细胞毒作用。结论成功构建并实现TNFR1BP/IgGFc融合蛋白真核表达;体外实验证实此融合蛋白可通过与细胞表面TNFR1结合,从而拮抗sTNF-α介导的生物学效应。

关键词：肿瘤坏死因子-α 真核表达 IgGFc融合蛋白封闭肽

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新型融合蛋白pro-SIRPα的构建及体外活性研究

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现代免疫学 2016年第2期36卷 89-95页

作者：赵一蓉徐进郭怀祖李彦韬陈曦钱卫珠李晶李博华第二军医大学肿瘤研究所上海200433 抗体药物与靶向治疗国家重点实验室上海201203

筛选获得肿瘤特异性释放封闭肽的高亲和力新型融合蛋白pro-SIRPα并对其体外活性进行了研究。首先利用噬菌体表面展示肽库筛选能与信号调节蛋白SIRPα-cv1活性区结合的短肽,并以含有尿激酶(uPA)酶切位点的linker将其连接在SIRPα-cv1融... 详细信息

筛选获得肿瘤特异性释放封闭肽的高亲和力新型融合蛋白pro-SIRPα并对其体外活性进行了研究。首先利用噬菌体表面展示肽库筛选能与信号调节蛋白SIRPα-cv1活性区结合的短肽,并以含有尿激酶(uPA)酶切位点的linker将其连接在SIRPα-cv1融合蛋白的氨基末端,构建完整的pro-SIRPα。通过竞争ELISA实验验证pro-SIRPα前端封闭肽具有封闭效应。由于氨基端封闭肽的存在,pro-SIRPα与CD47的结合能力显著下降。而肿瘤微环境中富含uPA,可水解pro-SIRPα氨基末端的linker,使得封闭肽解离并暴露出的完整SIRPα-cv1,恢复与CD47的结合能力。因此,pro-SIRPα可特异性作用于肿瘤细胞,减少了与正常血液系统细胞的非特异性结合,降低了毒性以及可能引起的抗原沉默(antigen sink effect)现象。我们的体外实验还证实,与单独应用抗EGFR-IgG1单抗相比,pro-SIRPα与抗EGFR-IgG1单抗联用可显著增强巨噬细胞对A431肿瘤细胞的吞噬作用。pro-SIRPα的研制可能为肿瘤靶向治疗提供新的策略。

关键词： SIRPα CD47 封闭肽高亲和力突变体

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新型融合蛋白Pro-SIRPα的构建及生物学活性研究

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作者：赵一蓉第二军医大学

学位级别：硕士

跨膜糖蛋白CD47,属于免疫球蛋白超家族的一种跨膜蛋白,广泛表达于多组织细胞表面,如红细胞、血小板、淋巴细胞、肝细胞及肿瘤细胞等。其生理功能多样,参与细胞与胞外基质的相互作用,与细胞凋亡、增殖、迁移等细胞学过程关系密切并且参... 详细信息

跨膜糖蛋白CD47,属于免疫球蛋白超家族的一种跨膜蛋白,广泛表达于多组织细胞表面,如红细胞、血小板、淋巴细胞、肝细胞及肿瘤细胞等。其生理功能多样,参与细胞与胞外基质的相互作用,与细胞凋亡、增殖、迁移等细胞学过程关系密切并且参与肿瘤免疫逃逸的机制。目前,CD47这一靶点已用于研究治疗多种疾病如白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓瘤及其他实体瘤。信号调节蛋白α(SIRPα,signal regulatory protein-α),作为免疫球蛋白超家族膜蛋白的成员之一,是SIRP家族中一个典型的抑制性受体。其特异性的表达于髓系细胞如巨噬细胞、树突状细胞,以及神经细胞膜表面。CD47是SIRPα的天然配体,CD47-SIRPα信号通路在多种生理机制中发挥作用。其中,以在体内巨噬细胞吞噬过程中发挥的作用为最有特征性的。当巨噬细胞表面的SIRPα在与肿瘤细胞表面的CD47分子结合后,会介导“Don’t eat me”的信号,使肿瘤细胞免于巨噬细胞的吞噬,发生免疫逃逸,进而导致肿瘤进展。然而,在正常血液系统细胞表面也会有少量的CD47表达,CD47-SIRPα信号通路参与红细胞吞噬过程的调节,也一定程度上参与血小板及淋巴细胞的调节。因而,传统的抗CD47抗体类药物都会引起一定程度的血液系统副作用,从而影响靶向CD47抗体药物的临床应用前景。针对这一问题,本研究构建了可在肿瘤部位特异性释放封闭肽的高亲和力新型融合蛋白pro-SIRPα,并对其生物学活性进行了研究。首先利用噬菌体表面展示肽库技术筛选得到与突变型信号调节蛋白SIRPα-cv1活性区特异性结合的短肽(12肽),作为封闭肽(masking peptide)降低SIRPα-cv1与CD47的结合亲和力,从而减少SIRPα-cv1与非肿瘤部位的CD47结合的可能,减少“抗原沉默”(antigen sink effect)现象的发生。然后,通过含有尿激酶(uPA)酶切位点的柔性多肽linker将封闭肽连接在SIRPα-cv1融合蛋白的氨基末端(N-端),构建为完整的pro-SIRPα。在肿瘤微环境下,linker在uPA酶的作用下水解,释放前端短肽,暴露pro-SIRPα与CD47的结合位点,从而起到竞争性结合CD47的作用,有效抑制肿瘤的进展。体外实验中,本研究通过竞争ELISA验证了pro-SIRPα前端封闭肽是否具有封闭效应。实验结果表明:由于氨基端封闭肽的存在,pro-SIRPα与CD47的结合能力显著下降。而用肿瘤微环境中富含的uPA酶水解后,pro-SIRPα氨基末端的linker断裂,使得封闭肽脱离并暴露出完整的SIRPα-cv1,恢复与CD47的结合能力。因此,由于封闭肽的存在,新型融合蛋白pro-SIRPα对肿瘤组织的特异性得到了明显的提高,减少了其与正常血液系统细胞的结合,降低了潜在的血液毒性以及可能引起的抗原沉默(antigen sink effect)现象。此外,本研究还证实,与单独应用抗EGFR的单抗相比,uPA处理后的pro-SIRPα与抗EGFR-单抗联用可显著增强巨噬细胞对A431肿瘤细胞的吞噬作用。靶向阻断肿瘤部位的CD47-SIRPα信号通路,可有效促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。而pro-SIRPα的研制可能为肿瘤靶向治疗提供新的策略。

关键词： SIRPα CD47 封闭肽高亲和力突变体 pro-SIRPα

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