新型融合蛋白Pro-SIRPα的构建及生物学活性研究

作     者：赵一蓉 

作者单位：第二军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李博华

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：SIRPα CD47 封闭肽 高亲和力突变体 pro-SIRPα 

摘      要：跨膜糖蛋白CD47,属于免疫球蛋白超家族的一种跨膜蛋白,广泛表达于多组织细胞表面,如红细胞、血小板、淋巴细胞、肝细胞及肿瘤细胞等。其生理功能多样,参与细胞与胞外基质的相互作用,与细胞凋亡、增殖、迁移等细胞学过程关系密切并且参与肿瘤免疫逃逸的机制。目前,CD47这一靶点已用于研究治疗多种疾病如白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓瘤及其他实体瘤。信号调节蛋白α(SIRPα,signal regulatory protein-α),作为免疫球蛋白超家族膜蛋白的成员之一,是SIRP家族中一个典型的抑制性受体。其特异性的表达于髓系细胞如巨噬细胞、树突状细胞,以及神经细胞膜表面。CD47是SIRPα的天然配体,CD47-SIRPα信号通路在多种生理机制中发挥作用。其中,以在体内巨噬细胞吞噬过程中发挥的作用为最有特征性的。当巨噬细胞表面的SIRPα在与肿瘤细胞表面的CD47分子结合后,会介导“Don’t eat me的信号,使肿瘤细胞免于巨噬细胞的吞噬,发生免疫逃逸,进而导致肿瘤进展。然而,在正常血液系统细胞表面也会有少量的CD47表达,CD47-SIRPα信号通路参与红细胞吞噬过程的调节,也一定程度上参与血小板及淋巴细胞的调节。因而,传统的抗CD47抗体类药物都会引起一定程度的血液系统副作用,从而影响靶向CD47抗体药物的临床应用前景。针对这一问题,本研究构建了可在肿瘤部位特异性释放封闭肽的高亲和力新型融合蛋白pro-SIRPα,并对其生物学活性进行了研究。首先利用噬菌体表面展示肽库技术筛选得到与突变型信号调节蛋白SIRPα-cv1活性区特异性结合的短肽(12肽),作为封闭肽(masking peptide)降低SIRPα-cv1与CD47的结合亲和力,从而减少SIRPα-cv1与非肿瘤部位的CD47结合的可能,减少“抗原沉默(antigen sink effect)现象的发生。然后,通过含有尿激酶(uPA)酶切位点的柔性多肽linker将封闭肽连接在SIRPα-cv1融合蛋白的氨基末端(N-端),构建为完整的pro-SIRPα。在肿瘤微环境下,linker在uPA酶的作用下水解,释放前端短肽,暴露pro-SIRPα与CD47的结合位点,从而起到竞争性结合CD47的作用,有效抑制肿瘤的进展。体外实验中,本研究通过竞争ELISA验证了pro-SIRPα前端封闭肽是否具有封闭效应。实验结果表明:由于氨基端封闭肽的存在,pro-SIRPα与CD47的结合能力显著下降。而用肿瘤微环境中富含的uPA酶水解后,pro-SIRPα氨基末端的linker断裂,使得封闭肽脱离并暴露出完整的SIRPα-cv1,恢复与CD47的结合能力。因此,由于封闭肽的存在,新型融合蛋白pro-SIRPα对肿瘤组织的特异性得到了明显的提高,减少了其与正常血液系统细胞的结合,降低了潜在的血液毒性以及可能引起的抗原沉默(antigen sink effect)现象。此外,本研究还证实,与单独应用抗EGFR的单抗相比,uPA处理后的pro-SIRPα与抗EGFR-单抗联用可显著增强巨噬细胞对A431肿瘤细胞的吞噬作用。靶向阻断肿瘤部位的CD47-SIRPα信号通路,可有效促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。而pro-SIRPα的研制可能为肿瘤靶向治疗提供新的策略。