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随机单链DNA文库SELEX筛选寡核苷酸适配子方法的建立

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生物化学与生物物理进展 2003年第1期30卷 151-155页

作者：詹林盛邵宁生彭剑淳孙红琰王全立军事医学科学院输血医学研究所北京100850 军事医学科学院基础医学研究所北京100850

指数富集配基的系统进化 (SELEX)技术是一种新的组合化学技术 .体外构建了一个长度为 81nt、含有35个随机序列的单链DNA (ssDNA)文库 ,优化了ssDNA文库扩增为双链DNA (dsDNA)文库的PCR反应条件 .通过对比不对称PCR和生物素 -链亲和素磁... 详细信息

指数富集配基的系统进化 (SELEX)技术是一种新的组合化学技术 .体外构建了一个长度为 81nt、含有35个随机序列的单链DNA (ssDNA)文库 ,优化了ssDNA文库扩增为双链DNA (dsDNA)文库的PCR反应条件 .通过对比不对称PCR和生物素 -链亲和素磁珠分离方法制备ssDNA文库的效果 ,确定了以生物素 -链亲和素磁珠分离方法制备ssDNA .由于脱氧核糖核酸的疏水性导致ssDNA文库与硝酸纤维素滤膜的结合背景过高 ,因此选择以微孔板为介质 ,分离与靶蛋白结合的适配子 .经过 9轮循环筛选 ,随机ssDNA文库与丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白 (C蛋白 )的结合率从 0 . 5 %上升到 32 . 5 % .

关键词：随机单链DNA文库 SELEX技术筛选寡核苷酸适配子丙型肝炎病毒核心蛋白

丙型肝炎病毒核心蛋白寡核苷酸适配子的筛选与鉴定

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中华微生物学和免疫学杂志 2002年第5期22卷 578-581页

作者：詹林盛孙红琰彭剑淳邵宁生王全立军事医学科学院输血研究所军事医学科学院基础医学研究所

目的　筛选、鉴定抗HCV核心蛋白 (C蛋白 )的寡核苷酸适配子 (aptamers)。方法　利用systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment (SELEX)技术 ,以HCVC蛋白为靶分子 ,从体外合成的 81bp随机单链DNA文库中筛选与HCVC蛋白特异结... 详细信息

目的　筛选、鉴定抗HCV核心蛋白 (C蛋白 )的寡核苷酸适配子 (aptamers)。方法　利用systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment (SELEX)技术 ,以HCVC蛋白为靶分子 ,从体外合成的 81bp随机单链DNA文库中筛选与HCVC蛋白特异结合的寡核苷酸适配子 ,并进行了解离常数 (Kd)测定和适配子序列测定。再分别利用ClustalW软件包和DNAFoldingSever分析适配子的一级结构和二级结构。结果　经过 9轮循环筛选 ,随机ssDNA库与HCVC蛋白的结合率从 0 .5 %上升到32 .5 %。所有的一级结构没有共同的同源序列 ,但可分 5个家族 ,每个家族具有共同的保守序列。二级结构分析表明 ,适配子形成的茎环、凸环结构可能是与HCVC蛋白结合的结构基础。其中寡核苷酸适配子C4与HCVC蛋白特异结合的亲和力最高 ,Kd值为 6 8nmol L。

关键词：丙型肝炎丙型肝炎病毒核心蛋白 SELEX技术寡核苷酸适配子

SSCP在寡核苷酸适配子ssDNA多克隆筛选中的应用

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沈阳药科大学学报 2008年第5期25卷 409-413页

作者：祝军汪丽张景海沈阳药科大学生命科学与生物制药学院辽宁沈阳110016

目的利用单链构象多态性技术弥补SELEX(systematic evolution of ligands by exponential en-richment,SELEX)实验在寡核苷酸适配子克隆、测序环节中的不足,减少SELEX实验的环节。方法利用单链构象多态性技术(singel-strand conformation polymorphism,SSCP)将多轮SELEX筛选的198个寡核苷酸适配子克隆在测序前进行SSCP筛查。结果对198个克隆的SSCP电泳条带位置分析,挑选出58个克隆测序。SSCP筛查得到有效克隆的检出率为20.69%,是不用SSCP筛查检出率6.07%的3.4倍;如果去除组间误差,有效克隆的检出率44.44%是不用SSCP筛查检出率的7.32倍。结论通过对198个克隆的20批次SSCP电泳筛查,并经58个克隆测序后的实验结果证明:同一SSCP电泳胶片上电泳条带泳动位置相同的克隆片段,基因序列相同;电泳条带泳动位置不同的片段,基因序列不同。根据SSCP电泳条带泳动位置,挑选有代表性的克隆测序,避免对多克隆盲目测序,为多克隆测序前的筛查探索一条新的途径。

关键词：单链构象多态性技术(sscP) 指数级富集的配体系统进化(SELEX) 寡核苷酸适配子多克隆测序

生物素-亲合素ELISA法对ANEPⅢ寡核苷酸适配子亲和力的定量测定

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细胞与分子免疫学杂志 2007年第6期23卷 580-581,584页

作者：祝军张景海沈阳药科大学生命科学与生物制药学院辽宁沈阳110016

目的:定量分析SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)筛选中寡核苷酸适配子的亲和力。方法:利用生物素和亲合素放大系统(BA-辣根过氧化物酶复合物系统)应用于ELISA的实验策略,对ANEPⅢ寡核苷酸适配子的亲... 详细信息

目的:定量分析SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)筛选中寡核苷酸适配子的亲和力。方法:利用生物素和亲合素放大系统(BA-辣根过氧化物酶复合物系统)应用于ELISA的实验策略,对ANEPⅢ寡核苷酸适配子的亲合力进行测定。结果:确定BA-ELISA方法定量分析测定寡核苷酸适配子的基本实验步骤。结论:BA-ELISA法可以替代IFMA(免疫荧光测定试验)或放射性荧光标记方法进行寡核苷酸适配子的亲和力的定量测定。

关键词： SELEX筛选寡核苷酸适配子亲和力 BA-ELISA

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寡核苷酸适配子在核医学中的应用

中华核医学杂志 2006年第4期26卷 246-249页

作者：穆传杰韩佩珍中国医学科学院

寡核苷酸适配子（aptamer，ataptable oligomer）是用指数富集配基的系统进化（SELEX）技术，通过体外筛选、扩增和富集获得能和小分子物质、多肽、蛋白质、细胞器、核酸及细胞和组织等靶物质高亲和、高特异结合的修饰寡核苷酸。适配子... 详细信息

寡核苷酸适配子（aptamer，ataptable oligomer）是用指数富集配基的系统进化（SELEX）技术，通过体外筛选、扩增和富集获得能和小分子物质、多肽、蛋白质、细胞器、核酸及细胞和组织等靶物质高亲和、高特异结合的修饰寡核苷酸。适配子（aptamer）来源于拉丁语“aptus”一词，意为“使适合”。

关键词：寡核苷酸适配子核医学小分子物质体外筛选特异结合细胞器蛋白质拉丁语

SELEX筛选LPS寡核苷酸适配子方法的建立

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重庆医学 2008年第16期37卷 1773-1775页

作者：杨清武文爱清吕凤林陈彩宇第三军医大学大坪医院野战外科研究所神经内科重庆400042

目的建立SELEX筛选LPS的适配子方法,为后续大规模筛选奠定基础。方法在成功构建含40个随机序列的单链DNA(ssDNA)文库的基础上,优化了扩增为双链DNA(dsDNA)文库的PCR反应条件;同时对液相筛选与固液相筛选两种方法进行比较,确定最优的筛... 详细信息

目的建立SELEX筛选LPS的适配子方法,为后续大规模筛选奠定基础。方法在成功构建含40个随机序列的单链DNA(ssDNA)文库的基础上,优化了扩增为双链DNA(dsDNA)文库的PCR反应条件;同时对液相筛选与固液相筛选两种方法进行比较,确定最优的筛选方法并进行4轮筛选。结果确定了扩增为双链DNA(dsDNA)文库的PCR反应的最佳条件,采用液相筛选方法经过4轮筛选,随机单链DNA(ssDNA)文库与内毒素(LPS)的结合率明显上升,CPM值与初始库相比差异有统计学意义。结论建立了SELEX筛选LPS寡核苷酸适配子的筛选方法。

关键词：随机ssDNA文库指数富集配基的系统进化(SELEX) 寡核苷酸适配子 LPS

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蓖麻毒素寡核苷酸适配子筛选方法的比较研究

蓖麻毒素寡核苷酸适配子筛选方法的比较研究

作者：唐吉军中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

蓖麻毒素蛋白来源于蓖麻籽中,由A、B两条肽链通过二硫键连接而成。其中,A链为效应链,具有糖苷酶活性,能使核糖体失活;B链为结合链,含有两个半乳糖结合位点。其毒性作用机理主要是抑制蛋白质合成。指数富集的配基系统进化(SELEX),... 详细信息

蓖麻毒素蛋白来源于蓖麻籽中,由A、B两条肽链通过二硫键连接而成。其中,A链为效应链,具有糖苷酶活性,能使核糖体失活;B链为结合链,含有两个半乳糖结合位点。其毒性作用机理主要是抑制蛋白质合成。指数富集的配基系统进化(SELEX),也称之为体外筛选。通过这项技术能够从庞大的核酸文库中筛选获得与靶分子具有高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸适配子。由于寡核苷酸适配子结合的靶物质范围广,包括小分子、多肽、蛋白和细胞等,而且与靶分子结合的亲和力高、特异性强,所以SELEX技术在基础研究、药物筛选以及临床诊断等方面显示了广阔的应用前景。本研究的目的是借助SELEX技术从随机ssDNA文库中筛选获得特异识别蓖麻毒素蛋白的寡核苷酸适配子,为开展对蓖麻毒素生物传感器研究和阻断剂研究奠定了基础。全文分为两部分: 一、构建了含40个随机序列全长87nt的随机ssDNA文库,采用微孔法和亲和树脂层析法两种传统的SELEX筛选方法对蓖麻毒素进行筛选。随机挑选的22条适配子的一级序列可分为6个家族,模拟的二级结构中存在茎环、凸环结构,这可能是与靶蛋白作用的结构基础。亲和力测定结果显示,适配子A3的亲和力最高,Kd值为105nM。二、将高效毛细管电泳技术作为分离手段引入到对蓖麻毒素蛋白的SELEX筛选中,建立了全新的高效、快速的CE-SELEX筛选平台。硝酸纤维膜结合实验结果表明,仅经CE-SELEX两轮筛选后富集文库与蓖麻毒素靶蛋白的结合率就上升至60.2%,而四轮筛选之后高达87.2%。随机挑选的11条寡核苷酸适配子根据序列同源性分析的结果分为3个家族,其中两条序列C1、C5与蓖麻毒素的亲和力较高,

关键词：蓖麻毒素蛋白寡核苷酸适配子指数富集配基的系统进化毛细管电泳随机单链DNA文库

金纳米颗粒修饰寡核苷酸适配子对蛋白质进行比色检测方法

同方学位论文库评论

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公共卫生与预防医学 2006年第5期17卷 26-28页

作者：张迟李柏生赵立凡张丽君徐顺清华中科技大学同济医学院公共卫生学院环境医学研究院武汉430030 华中科技大学同济医学院公共卫生学院教育部环境与健康重点实验室

目的利用核酸适配体(aptamer)建立一种检测与疾病有关蛋白质的新方法。方法用金纳米颗粒(AuNP)修饰的寡核苷酸适配子与蛋白质结合,同时另一个生物素化的寡核苷酸适配子也结合于蛋白质,构成一个三明治形式的复合物,接着三明治复合物被卵... 详细信息

目的利用核酸适配体(aptamer)建立一种检测与疾病有关蛋白质的新方法。方法用金纳米颗粒(AuNP)修饰的寡核苷酸适配子与蛋白质结合,同时另一个生物素化的寡核苷酸适配子也结合于蛋白质,构成一个三明治形式的复合物,接着三明治复合物被卵白素结合于酶标板上,利用银离子强化技术对复合物上的蛋白质浓度信息进行放大,然后用酶标仪对吸光度进行检测。结果(1)本研究可以得到吸光度与PDGF-BB浓度的剂量-效应关系曲线,在一定的浓度范围内(1fM^1μM),吸光度与PDGF-BB浓度的对数值呈线形相关,决定系数R2=0.9801;(2)本方法可以检测出1fmol/L的靶蛋白质。结论本方法有较高灵敏度,不需要复杂的仪器,易于操作,是一种新颖而应用前景的蛋白质标志物分析方法。

关键词：寡核苷酸适配子蛋白质纳米颗粒银离子强化

指数富集配基系统进化技术筛选泡沫细胞寡核苷酸适配子

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指数富集配基系统进化技术筛选泡沫细胞寡核苷酸适配子