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密闭培养条件下小鼠早期胚胎Igf2/H19印迹调控区甲基化状态分析

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中国生物化学与分子生物学报 2010年第7期26卷 672-677页

作者：陈海燕马保华刘洁赵晓娥曹宇静雷晓华西北农林科技大学动物医学院农业部动物生殖生理和胚胎工程重点开放实验室陕西杨凌712100 中国科学院动物研究所生殖生物学国家重点实验室北京100101

胚胎密闭培养是空间胚胎发育研究的基本条件.本文主要研究密闭培养条件对小鼠早期胚胎发育过程中印迹基因Igf2/H19的印迹调控区(ICR)甲基化水平的影响.应用亚硫酸氢盐测序法(BSP)分析小鼠2-细胞胚胎在密闭条件下分别培养24h、48h和72h后... 详细信息

胚胎密闭培养是空间胚胎发育研究的基本条件.本文主要研究密闭培养条件对小鼠早期胚胎发育过程中印迹基因Igf2/H19的印迹调控区(ICR)甲基化水平的影响.应用亚硫酸氢盐测序法(BSP)分析小鼠2-细胞胚胎在密闭条件下分别培养24h、48h和72h后,相对应的发育阶段胚胎Igf2/H19的ICR甲基化水平,以常规体外培养和体内发育的各阶段胚胎为对照.结果显示,密闭培养条件下,小鼠8-细胞胚胎、桑葚胚和囊胚的Igf2/H19的ICR甲基化水平都低于常规体外培养的结果,且更明显低于体内发育的结果;同时发现,小鼠8-细胞胚胎密闭培养时,Igf2/H19的ICR甲基化水平最低.由此可见,密闭培养会引起小鼠植入前各发育阶段胚胎Igf2/H19的ICR甲基化水平降低,并证明Igf2/H19的ICR甲基化水平可以作为监测哺乳动物早期胚胎发育状况的分子指标.

关键词：密闭培养胚胎甲基化印迹基因Igf2/H19 小鼠

培养液充气时间对小鼠4细胞胚胎密闭培养效果的影响

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2021年第5期49卷 1-7页

作者：刘洁王丹丹陈芳谷建锋王兆赵晓娥马保华西北农林科技大学动物医学院农业部动物生物技术重点实验室陕西杨凌712100

【目的】研究标准气充气时间对密闭培养的小鼠4细胞胚胎体外发育的影响,为太空环境下哺乳动物的早期胚胎发育研究奠定基础。【方法】用气体组成为体积分数5%O 2、5%CO 2、90%N 2的高纯标准气对胚胎培养液进行充气处理,充气时间设为30,60... 详细信息

【目的】研究标准气充气时间对密闭培养的小鼠4细胞胚胎体外发育的影响,为太空环境下哺乳动物的早期胚胎发育研究奠定基础。【方法】用气体组成为体积分数5%O 2、5%CO 2、90%N 2的高纯标准气对胚胎培养液进行充气处理,充气时间设为30,60,90,120,150,180和240 min,用充气培养液对小鼠4细胞胚胎进行密闭培养,以常规体外微滴培养的胚胎为对照,分别在培养12,36,60,84 h时检测各组体外培养胚胎过氧化物的积累情况和缺氧诱导因子(HIF-1α)表达的变化,并于培养84 h统计囊胚发育率、孵化率和囊胚总细胞数。【结果】当充气时间≥180 min时,胚胎发育早期存在明显的过氧化物积累现象;当充气时间≤120 min时,胚胎发育过程中可以检测到HIF-1α,表明出现缺氧现象。密闭培养条件下,培养液充气120~180 min时的小鼠胚胎囊胚发育率、孵化率和囊胚总细胞数较高,分别为93.38%~95.68%,61.03%~65.27%和102.33~111.83,其中囊胚发育率和囊胚总细胞数与对照组差异不显著(P>0.05),而囊胚孵化率显著高于对照组(P密闭培养体系适合的培养液充气方案为:用气体组成比例为体积分数5%O 2、5%CO 2、90%N 2的高纯标准气充气120~150 min,此方案下进行密闭培养的小鼠胚胎可获得较高的发育率,并可有效排除缺氧对早期胚胎体外发育的影响,同时保护胚胎免受过氧损伤。

关键词：氧自由基缺氧诱导因子-1α 密闭培养小鼠胚胎

密闭培养条件对小鼠早期胚胎发育及胚胎Igf2/H19印迹调控区甲基化影响的研究

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密闭培养条件对小鼠早期胚胎发育及胚胎Igf2/H19印迹调控区甲基化...

作者：陈海燕西北农林科技大学

学位级别：硕士

空间胚胎发育研究已成为空间生命科学研究的重要内容之一,而胚胎密闭培养是空间胚胎发育研究的基本条件。由于气密和液密的限制,使密闭培养必须选择最适的哺乳动物早期胚胎长期体外培养的密度条件、气相条件、培养液成分等。因此能够满... 详细信息

空间胚胎发育研究已成为空间生命科学研究的重要内容之一,而胚胎密闭培养是空间胚胎发育研究的基本条件。由于气密和液密的限制,使密闭培养必须选择最适的哺乳动物早期胚胎长期体外培养的密度条件、气相条件、培养液成分等。因此能够满足胚胎发育的营养物质和代谢废物平衡的适宜的胚胎培养密度(培养胚胎数和培养液体积之比)成为首要研究内容之一。其次由于小鼠早期胚胎对环境的敏感性以及胚胎中与发育相关基因的表观遗传模式易受发育环境影响而改变,特别是Igf2/H19印迹调控区(Imprinting Control Region,ICR)的甲基化印迹容易受到体外操作和体外培养条件的影响而发生变化。因此本研究主要围绕密闭培养条件对小鼠2-细胞胚胎发育和Igf2/H19 ICR甲基化水平的影响进行初步探讨,并对密闭培养体系的优化进行进一步的深入研究和探索,从而为哺乳动物胚胎空间生物学研究提供新的研究手段和地基数据资料。 1.在本研究设立的充有5%O2,5%CO2,90%N2高纯标准气于200μL的CZB培养液的密闭培养条件下,分析在培养胚胎数:培养液体积为1:4、1:2、1:1的3个密度条件下小鼠2-细胞胚胎分别进行4个时间点(24 h, 48 h, 72 h, 96 h)培养的胚胎发育率,以相应培养密度的常规体外培养各期胚胎发育率作为评定密闭培养条件的标准。本研究证实密闭培养和常规体外培养条件下,1:2的培养密度都比1:1和1:4更适合小鼠2-细胞胚胎培养;而且虽然密闭培养的胚胎发育率和发育速度都低于常规体外培养,但是培养96 h的孵化胚发育率几乎相同(75.1%,78.1%),可见该密闭培养条件可以用于小鼠2-细胞胚胎体外培养。 2.应用亚硫酸氢盐PCR测序法(BSP)分析密闭培养条件下小鼠2-细胞胚胎分别培养24 h、48 h、72 h时相对应的8-细胞胚胎、桑葚胚、囊胚中Igf2/H19印记调控区(ICR)的甲基化水平,以常规体外培养条件下相应胚胎的甲基化水平作为对照,以体内发育的相应胚胎的甲基化水平作为标准。本研究证实密闭培养条件下各胚胎期Igf2/H19 ICR的甲基化水平都低于常规体外培养的结果,更低于体内发育的结果,可见密闭培养会引起小鼠早期胚胎Igf2/H19 ICR的甲基化水平降低。同时证实Igf2/H19 ICR的甲基化水平可以作为监测哺乳动物早期胚胎发育状况的一个分子指标。

关键词：密闭培养甲基化胚胎 Igf2/H19 小鼠

小鼠4细胞胚胎密闭培养体系的建立及胚胎密闭培养条件筛选研究

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小鼠4细胞胚胎密闭培养体系的建立及胚胎密闭培养条件筛选研究

作者：刘洁西北农林科技大学

学位级别：硕士

作为空间生命科学重要研究内容之一,胚胎的空间发育研究一直受到国内外研究者的高度关注。但是目前所普遍采用的开放式胚胎培养体系无法在真空、失重的环境中支持早期胚胎的体外发育,因此必须选用密闭培养的方式(包括气密和液密)进行胚... 详细信息

作为空间生命科学重要研究内容之一,胚胎的空间发育研究一直受到国内外研究者的高度关注。但是目前所普遍采用的开放式胚胎培养体系无法在真空、失重的环境中支持早期胚胎的体外发育,因此必须选用密闭培养的方式(包括气密和液密)进行胚胎空间密闭培养。胚胎密闭培养就是在胚胎培养前预先向胚胎培养液中充入含有一定比例O,CO和N的标准气以提供胚胎发育的气相支持。同时,由于密闭培养的特殊性,在胚胎发育的过程中无法向体系中补充更新营养与气相成分,因此适宜的胚胎培养密度对体系能否更长时间支持胚胎体外发育至关重要。本研究通过对胚胎培养液充气标准气,胚胎培养液以及胚胎培养密度的筛选,以建立一种可支持早期胚胎体外发育的密闭培养体系,并应用于空间环境条件对胚胎发育影响的研究。 1.本研究选择了两种O比例不同的标准气(5% O,5% CO,90% N和10% O,5% CO,85% N)、两种营养条件和缓冲体系不同的胚胎培养液(添加10%胎牛血清的mDPBS和CZB液),并在培养液体积为200μL的前提下,选用三种培养密度(胚胎数/n∶培养液体积/μL为1:1, 1:2和1:4),进行小鼠4细胞胚胎的密闭培养,同时设置不充气培养组和常规微滴培养对照组。通过观察和分析各组胚胎在密闭培养84 h时的囊胚发育率和胚胎孵化率,判定各培养组的胚胎培养效果。结果表明,利用5% O比例的标准气进行胚胎培养液充气时,mDPBS和CZB液表现出类似的胚胎培养结果。1:1培养组的囊胚发育率与对照组无显著差异(P>0.05),但胚胎孵化率显著低于相同培养密度的对照组(P培养组的囊胚发育率与胚胎孵化率与相同培养密度的对照组无显著差异(P>0.05);1:4培养组无论是囊胚发育率还是胚胎孵化率皆显著低于相同培养密度的对照组(P培养液充气时,mDPBS和CZB液表现出类似的胚胎培养结果。1:1培养组的囊胚发育率和胚胎孵化率与相同培养密度的对照组无显著差异(P>0.05);1:2培养组和1:4培养组的囊胚发育率和胚胎孵化率皆显著低于相同培养密度的对照组(P培养液不充气密闭培养时,1:1培养组,1:2培养组和1:4培养组的囊胚发育率与胚胎孵化率皆显著低于相同培养密度的对照组。证明,在密闭培养体系中,胚胎培养密度过低会导致胚胎发育率和胚胎孵化率下降;培养液不充气密闭培养不能支持小鼠4细胞胚胎体外发育。 2.在上述研究结果的基础上,在5% O比例的标准气进行胚胎培养液充气时,利用mDPBS和CZB对小鼠4细胞胚胎进行密闭培养,以筛选小鼠胚胎密闭培养的适宜培养液。结果表明,相同培养密度下在mDPBS培养液中发育的胚胎,囊胚总细胞数显著低于在CZB培养液中发育的胚胎(P培养液支持密闭培养小鼠胚胎发育的能力优于mDPBS培养液。 3.在上述研究结果的基础上,以CZB培养液为胚胎培养液,分别利用5% O比例和10% O比例的标准气进行胚胎培养液充气,比较不同培养密度下囊胚细胞总数以及囊胚细胞凋亡率的差异,并检测胚胎发育早期过氧化物产生情况和密闭培养过程中胚胎缺氧诱导因子1 alpha(HIF-1α)蛋白质表达情况。结果显示,利用5% O比例的标准气进行胚胎培养液充气时,1:1培养组的囊胚细胞总数显著低于相同密度的对照组胚胎(P培养组的囊胚细胞总数以及胚胎细胞凋亡率皆与相同密度对照组胚胎无显著差异(P>0.05)。利用10% O比例的标准气进行胚胎培养液充气时,1:1培养组的囊胚细胞总数以及胚胎细胞凋亡率皆与相同密度对照组胚胎无显著差异(P>0.05);1:2培养组的囊胚细胞总数皆显著低于相同密度的对照组胚胎(P培养液充气,密闭培养12 h时1:1培养组和1:2培养组胚胎过氧化物产生量高于对照组,而在利用5% O比例的标准气进行胚胎培养液充气的密闭培养组中未见此现象。提示当标准气中O比例为10%时,密闭培养的胚胎在发育早期可能出现氧化损伤。利用5% O比例的标准气进行胚胎培养液充气时,1:1培养组在密闭培养60 h时胚胎中可检出HIF-1α表达;1:2培养组在密闭培养84 h时胚胎中可检出HIF-1α表达。利用10% O比例的标准气进行胚胎培养液充气时,1:1培养组在密闭培养84 h时胚胎中可检出HIF-1α表达;1:2培养组在密闭培养84 h时胚胎中未检出HIF-1α表达。综上所述,小鼠胚胎密闭培养的

关键词：密闭培养小鼠胚胎缺氧诱导因子氧化损伤

小鼠胚胎密闭培养体系培养温度和血清浓度优化及培养胚胎检测

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小鼠胚胎密闭培养体系培养温度和血清浓度优化及培养胚胎检测

作者：王丹丹西北农林科技大学

学位级别：硕士

在哺乳动物早期胚胎空间发育研究中,由于空间环境的特殊性和飞行器搭载限制,必须采用密闭培养(包括液密和气密)体系进行胚胎培养。密闭培养就是在培养前预先向胚胎培养液中充入气体比例明确的标准气,使标准气溶于培养液中,以提供胚胎发... 详细信息

在哺乳动物早期胚胎空间发育研究中,由于空间环境的特殊性和飞行器搭载限制,必须采用密闭培养(包括液密和气密)体系进行胚胎培养。密闭培养就是在培养前预先向胚胎培养液中充入气体比例明确的标准气,使标准气溶于培养液中,以提供胚胎发育的气相支持;然后快速地将充气培养液和早期胚胎装入密闭培养容器,并将培养容器密封后进行胚胎培养。本研究所在实验室已经初步确定适宜小鼠早期胚胎密闭培养的基础培养液、胚胎培养密度、培养液充气标准气气体比例以及充气时间,并依据发育相关生长因子及其受体在早期胚胎中的表达情况确定了适宜的生长因子添加方案。本研究在前期研究的基础上,通过对小鼠早期胚胎密闭培养体系适宜培养温度范围和血清浓度的筛选,进一步优化可支持早期胚胎体外正常发育的密闭培养体系;并应用实时荧光定量PCR技术检测优化密闭培养体系中胚胎主要转录因子的相对表达水平,以探讨优化的密闭培养体系是否能够支持小鼠早期胚胎正常发育。研究工作内容与研究结果为:1.使用气体比例为5%O2,5%CO2,90%N2的标准气对胚胎培养液充气130 min,向充气培养液中添加0.1 ng/mL EGF和1 ng/mL IGF-1后,立即在不同温度(36,36.5,37,37.5,38℃)下进行小鼠2细胞胚胎的密闭培养。通过分析密闭培养72 h和96 h后的胚胎发育率、胚胎细胞计数和密闭培养96 h后的胚胎细胞凋亡检测结果,筛选适宜小鼠早期胚胎密闭培养的温度范围。结果显示,当培养温度为36.5℃和37℃时,胚胎发育率和胚胎细胞总数较高,均显著高于其他各组,且密闭培养96 h后胚胎细胞凋亡率显著低于其他各组(P培养温度为36℃时,胚胎发育率降低,胚胎发育阻滞现象明显;当培养温度为37.5℃和38℃时,胚胎卵裂球缩小、碎裂,培养96 h后胚胎细胞凋亡率显著高于其他各组(P培养温度在36.57℃之间可较好地支持密闭培养体系中小鼠2细胞胚胎发育至囊胚和孵化胚阶段。依据本试验结果,在卫星硬件设计时我们选择使用36.8±0.2℃的温度控制系统。2.使用气体比例为5%O2,5%CO2,90%N2的标准气对不同胚胎培养液(含体积分数分别为2.5%,5%,7.5%,10%,15%,20%的胎牛血清)充气130 min,向充气培养液中添加0.1 ng/mL EGF和1 ng/mL IGF-1后立即进行小鼠2细胞胚胎的密闭培养。通过对密闭培养72 h和96 h后的胚胎发育率、胚胎细胞计数和密闭培养96 h后的胚胎细胞凋亡检测结果进行分析,筛选适宜小鼠早期胚胎密闭培养的血清浓度。结果显示,当培养液血清浓度为7.5%和10%时,密闭培养72 h后囊胚形成率、密闭培养96 h后囊胚孵化率以及胚胎细胞总数较高,胚胎细胞凋亡率较低,二者之间差异不显著(P>0.05),且二者均与其他各组差异显著(P培养液血清浓度为5%和15%时,胚胎发育率和胚胎细胞总数显著低于7.5%血清浓度组,且胚胎细胞凋亡率显著高于7.5%血清浓度组(P培养液血清浓度为2.5%时,部分胚胎发生退化,培养96 h后胚胎细胞凋亡率显著高于其他各组(P培养液血清浓度为20%时,密闭培养72 h后囊胚形成率显著低于其他各组(P培养液中添加7.5%0%的胎牛血清时,可较好地支持密闭培养体系中小鼠2细胞胚胎发育至囊胚和孵化胚阶段。在后续试验中,选择向胚胎培养液中添加7.5%的胎牛血清进行小鼠2细胞胚胎的密闭培养。3.在上述研究结果的基础上,使用气体比例为5%O2,5%CO2,90%N2的标准气对含体积分数为7.5%胎牛血清的胚胎培养液充气130 min,向充气培养液中添加0.1 ng/mL EGF和1 ng/mL IGF-1后立即在37℃下进行小鼠2细胞胚胎的密闭培养。应用实时荧光定量PCR技术对转录因子Oct4,Nanog,Sox2和Cdx2在密闭培养72 h后的小鼠囊胚中的表达情况进行检测,并与常规微滴培养72 h后的小鼠囊胚和体内同步发育胚胎相比较。结果显示,体外培养72 h后的密闭培养组胚胎中Oct4,Nanog,Sox2和Cdx2 mRNA相对表达水平都与体内同步发育胚胎差异不显著(P>0.05);微滴培养组胚胎中Oct4和Sox2 mRNA相对表达水平均略低于体内同步发育胚胎,但差异不显著(P>0.05);微滴培养组胚胎中Nanog和Cdx2 mRNA的相对表达水平均显著低于体内同步发育胚胎(P密闭培养体系中小鼠胚胎具有较好的发育潜能,该体系能够支持小鼠早期胚胎在密闭培养条件下正常发育。

关键词：培养温度血清浓度转录因子密闭培养小鼠胚胎

测定稻田土壤氮素矿化过程的淹水密闭培养法的条件试验

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土壤 1979年第6期 234-240页

作者：蔡贵信张绍林朱兆良中国科学院南京土壤研究所

关于土壤氮素矿化过程的测定目前有两种方法,即Stanford等的好气培养-间歇淋洗方法和淹水密闭培养法。前者适用于旱作土壤,后者适用于稻田土壤。淹水密闭培养法在具体应用时,尚有一些试验条件不够明确,如密闭方式,适宜的培养温度范围,... 详细信息

关于土壤氮素矿化过程的测定目前有两种方法,即Stanford等的好气培养-间歇淋洗方法和淹水密闭培养法。前者适用于旱作土壤,后者适用于稻田土壤。淹水密闭培养法在具体应用时,尚有一些试验条件不够明确,如密闭方式,适宜的培养温度范围,采用风干土时应预培多长时间,风干土土块细度对矿化过程的影响等。为此,我们于1978年进行该法的条件试验,所得结果如下。

关键词：密闭培养矿化过程风干土氮素矿化淹水条件试验

弓形虫病免疫的研究——弓形虫GJS株在密闭条件下培养的生物学特性观测

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中国兽医科技 1996年第3期26卷 12-14页

作者：杜重波张德林李惠萍马军武中国农业科学院兰州兽医研究所 730046

含2.5%血清的培养液中达到227万个/ml;在无血清的培养液中为208万个/ml,分别为5%CO_2条件下培养的2.7倍(227/84)和3.58倍(208/58);培养上清蛋白在142 h时是5%CO_2条件下的2.01倍(2.0028/0.995)和2.09倍(1.2995/0.619),即在密闭条件下培... 详细信息

关键词：弓形虫密闭培养生物学持性

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压力对微藻生长及固碳效果的影响

环境科学学报 2024年第10期44卷 227-234页

作者：严鹿鸣温馨茶建宾薛圣垣张永奎谢通慧自然资源部战略性矿产综合利用工程技术创新中心成都610041 四川大学化学工程学院制药与生物工程系成都610065

由于人类活动导致的温室气体排量升高加剧了全球变暖、海洋酸化等不利于生态多样性的进程,其中,二氧化碳占据总排量的70%以上.为减少其对生态环境的影响,必须研究二氧化碳的捕集与储存方法 .微藻凭借温和的培养条件、较高的光合作用效... 详细信息

由于人类活动导致的温室气体排量升高加剧了全球变暖、海洋酸化等不利于生态多样性的进程,其中,二氧化碳占据总排量的70%以上.为减少其对生态环境的影响,必须研究二氧化碳的捕集与储存方法 .微藻凭借温和的培养条件、较高的光合作用效率和生物质产率成为生物固碳领域的研究热点.本研究旨在探究达到最大胞外分泌的最佳气压条件,以此为策略提高微藻的碳固定能力.采用密闭、微正压等形式增强培养体系中二氧化碳从气相到液相的传递.结果表明,在1.25 ATM条件下,培养体系中微藻细胞达到了38.4 mg·L^(-1)的最大胞外有机碳分泌浓度.升高气压有利于促进微藻对培养基中无机氮、磷的吸收,培养体系的氮去除率最高达到31.92%,磷去除率最高达到45.00%.本研究结果将为突破微藻固碳的瓶颈提供可能,并推进微藻固碳的工业应用的可行性验证.

关键词：气压微藻密闭培养生物固碳

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一种适用于空间条件的材料防霉性能试验方法

载人航天 2017年第3期23卷 419-426页

作者：张文德印红徐侃彦航天神舟生物科技集团有限公司北京100190 北京市空间生物工程技术研究中心北京100190

空间环境下开展材料抗菌防霉性能测试试验是检验航天用材料防霉性能的必要试验环节。建立了一种适用于空间条件下的材料防霉性能试验方法。采用"材料层-孢子-供水层"夹心结构作为培养单元,通过喷涂方式将孢子附着在材料层表面。培养单... 详细信息

空间环境下开展材料抗菌防霉性能测试试验是检验航天用材料防霉性能的必要试验环节。建立了一种适用于空间条件下的材料防霉性能试验方法。采用"材料层-孢子-供水层"夹心结构作为培养单元,通过喷涂方式将孢子附着在材料层表面。培养单元初始为休眠状态,利用供水层供水作为培养单元激活条件。地面模拟验证试验表明培养单元可以支持黑曲霉孢子在非抗菌材料表面萌发,并在材料片表面均匀生长,为期28天试验中密闭培养与非密闭培养没有显著差异。

关键词：空间环境防霉材料孢子密闭培养