密闭培养条件对小鼠早期胚胎发育及胚胎Igf2/H19印迹调控区甲基化影响的研究

作     者：陈海燕 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马保华

授予年度：2010年

学科分类：0907[农学-林学] 090705[农学-野生动植物保护与利用] 09[农学] 

主      题：密闭培养 甲基化 胚胎 Igf2/H19 小鼠 

摘      要：空间胚胎发育研究已成为空间生命科学研究的重要内容之一,而胚胎密闭培养是空间胚胎发育研究的基本条件。由于气密和液密的限制,使密闭培养必须选择最适的哺乳动物早期胚胎长期体外培养的密度条件、气相条件、培养液成分等。因此能够满足胚胎发育的营养物质和代谢废物平衡的适宜的胚胎培养密度(培养胚胎数和培养液体积之比)成为首要研究内容之一。其次由于小鼠早期胚胎对环境的敏感性以及胚胎中与发育相关基因的表观遗传模式易受发育环境影响而改变,特别是Igf2/H19印迹调控区(Imprinting Control Region,ICR)的甲基化印迹容易受到体外操作和体外培养条件的影响而发生变化。因此本研究主要围绕密闭培养条件对小鼠2-细胞胚胎发育和Igf2/H19 ICR甲基化水平的影响进行初步探讨,并对密闭培养体系的优化进行进一步的深入研究和探索,从而为哺乳动物胚胎空间生物学研究提供新的研究手段和地基数据资料。 1.在本研究设立的充有5%O2,5%CO2,90%N2高纯标准气于200μL的CZB培养液的密闭培养条件下,分析在培养胚胎数:培养液体积为1:4、1:2、1:1的3个密度条件下小鼠2-细胞胚胎分别进行4个时间点(24 h, 48 h, 72 h, 96 h)培养的胚胎发育率,以相应培养密度的常规体外培养各期胚胎发育率作为评定密闭培养条件的标准。本研究证实密闭培养和常规体外培养条件下,1:2的培养密度都比1:1和1:4更适合小鼠2-细胞胚胎培养;而且虽然密闭培养的胚胎发育率和发育速度都低于常规体外培养,但是培养96 h的孵化胚发育率几乎相同(75.1%,78.1%),可见该密闭培养条件可以用于小鼠2-细胞胚胎体外培养。 2.应用亚硫酸氢盐PCR测序法(BSP)分析密闭培养条件下小鼠2-细胞胚胎分别培养24 h、48 h、72 h时相对应的8-细胞胚胎、桑葚胚、囊胚中Igf2/H19印记调控区(ICR)的甲基化水平,以常规体外培养条件下相应胚胎的甲基化水平作为对照,以体内发育的相应胚胎的甲基化水平作为标准。本研究证实密闭培养条件下各胚胎期Igf2/H19 ICR的甲基化水平都低于常规体外培养的结果,更低于体内发育的结果,可见密闭培养会引起小鼠早期胚胎Igf2/H19 ICR的甲基化水平降低。同时证实Igf2/H19 ICR的甲基化水平可以作为监测哺乳动物早期胚胎发育状况的一个分子指标。