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‘砀山酥梨’褐皮芽变中两个ERF基因的克隆与表达分析

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热带亚热带植物学报 2015年第4期23卷 379-385页

作者：王孟东杨金宇黄海娜朱立武衡伟安徽农业大学园艺学院合肥230036

为了解梨(Pyrus bretschneideri)中ERF基因的功能,采用3′RACE和pcr技术从‘砀山酥梨’中克隆了两个ERF基因,并对其表达进行了分析。克隆的两个ERF基因都具有典型的AP2/ERF结构域,属于ERF基因家族,分别命名为Pb ERF2和Pb ERF4,Gen Bank... 详细信息

为了解梨(Pyrus bretschneideri)中ERF基因的功能,采用3′RACE和pcr技术从‘砀山酥梨’中克隆了两个ERF基因,并对其表达进行了分析。克隆的两个ERF基因都具有典型的AP2/ERF结构域,属于ERF基因家族,分别命名为Pb ERF2和Pb ERF4,Gen Bank登录号分别为KJ623716和KJ623718。系统进化分析表明,Pb ERF2与枇杷ERF1,Pb ERF4与黄瓜ERF1的亲缘关系较近。表达分析表明,Pb ERF2和Pb ERF4在叶片中几乎不表达,果皮中的表达量高于果肉;‘锈酥’果皮3个发育时期的Pb ERF2和Pb ERF4表达量均显著高于‘砀山酥梨’,且均呈现先上升后下降的趋势。这为深入研究梨ERF基因家族的作用机理提供了理论依据。

关键词：梨 ERF基因实时荧光定量反转录pcr

实时荧光定量RT-pcr、细胞培养法和鸡胚培养法在流感检测中的对比分析

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中国卫生检验杂志 2015年第10期25卷 1555-1557页

作者：于翔翔杨焕森高玉朋李莉张学军连云港市疾病预防控制中心江苏连云港222003

目的比较本实验室已有的3种流感病毒检测方法的差异,以确定它们在不同情形下的适用方向。方法通过实时荧光定量反转录pcr、细胞培养和鸡胚培养3种方法同时检测488份流感样病例(ILI)鼻咽拭子样本,计算出它们的灵敏度和特异度,并进行统计... 详细信息

目的比较本实验室已有的3种流感病毒检测方法的差异,以确定它们在不同情形下的适用方向。方法通过实时荧光定量反转录pcr、细胞培养和鸡胚培养3种方法同时检测488份流感样病例(ILI)鼻咽拭子样本,计算出它们的灵敏度和特异度,并进行统计分析。结果实时荧光定量RT-pcr、细胞培养和鸡胚培养的阳性检测率分别为16.80%、6.76%、3.07%;相对于实时荧光定量RT-pcr,细胞培养的灵敏度为40.24%,特异度为100.00%,鸡胚培养的灵敏度为18.29%,特异度为100.00%;与细胞培养相比,鸡胚培养的灵敏度为45.45%,特异度为100.00%。结论3种方法在灵敏度方面差异很大,但在特异性上没有差异。由于实时荧光定量RT-pcr具有很高的灵敏度,并且检测速度快,适用于暴发疫情的应急检测;细胞培养和鸡胚培养作为经典的病毒分离方法,可以获得流感毒株,用来开展抗原性、基因特性和耐药性等深入研究。

关键词：实时荧光定量反转录pcr 细胞培养鸡胚培养流感病毒

斑秃患者外周血中Th17/Treg相关细胞因子的表达

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中国皮肤性病学杂志 2022年第6期36卷 652-659页

作者：杨英刘辉煌陈晓红陈税莹杨莹刘俊遵义医科大学第二附属医院皮肤科贵州遵义563003 遵义医科大学附属医院皮肤科贵州遵义563000 湖北医药学院附属国药东风总医院皮肤科湖北十堰442008 遵义医科大学公共卫生学院贵州遵义563003

目的检查斑秃患者外周血单个核细胞(PBMCs)经植物血凝素(PHA)刺激后IL-17A、IL-25、IL-35、IL-10 mRNA相对表达水平及其培养上清液中的分子水平,探讨其在斑秃发病中的作用。方法采用qRT-pcr、ELISA法,分别检测32例斑秃患者及30例正常对... 详细信息

目的检查斑秃患者外周血单个核细胞(PBMCs)经植物血凝素(PHA)刺激后IL-17A、IL-25、IL-35、IL-10 mRNA相对表达水平及其培养上清液中的分子水平,探讨其在斑秃发病中的作用。方法采用qRT-pcr、ELISA法,分别检测32例斑秃患者及30例正常对照组PBMCs中IL-17A、IL-25、IL-35(EBI3、p35)、IL-10 mRNA相对表达水平及其在PBMCs培养上清液中分子水平并进行相关性分析。结果重型斑秃患者PBMCs中IL-17A、IL-35(EBI3)、IL-10 mRNA均低于正常对照组(P0.05)。秩相关性分析:斑秃患者IL-17A、IL-10、IL-35(EBI3、p35)mRNA表达水平与SALT评分均呈负相关(r=-0.42,-0.45,-0.42,-0.43;P0.05);IL-25 mRNA表达水平与SALT评分、疾病的活动均无显著相关性(P>0.05),培养上清液中IL-17水平与疾病活动呈正相关(r=0.48,P0.05)。斑秃患者IL-17A与IL-25、IL-10、IL-35(EBI3、p35)mRNA表达水平均呈正相关(r=0.47,0.45,0.57,0.56;P0.05)。结论Th17/Treg细胞相关细胞因子(IL-17、IL-25、IL-10、IL-35)参与斑秃的发病,与斑秃疾病的严重程度存在一定的相关性,细胞因子间存在相互协同作用,在一定程度上可以为斑秃治疗提供理论依据。

关键词：斑秃白介素-17A 白介素-10 白介素-25 白介素-35 实时荧光定量反转录pcr 酶联免疫吸附法

溃疡性结肠炎患者肠黏膜干扰素γ与紧密连接蛋白的相关性研究

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溃疡性结肠炎患者肠黏膜干扰素γ与紧密连接蛋白的相关性研究

作者：来培培天津医科大学

学位级别：硕士

目的：溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种累及直肠和结肠黏膜的慢性非特异性炎症性疾病,其病因和发病机制至今尚未完全明确,也无理想的根治方法。有证据表明多种细胞因子,如Y干扰素(interferon-γ, IFN-γ)等所调节的免疫异... 详细信息

目的：溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种累及直肠和结肠黏膜的慢性非特异性炎症性疾病,其病因和发病机制至今尚未完全明确,也无理想的根治方法。有证据表明多种细胞因子,如Y干扰素(interferon-γ, IFN-γ)等所调节的免疫异常在UC的发病中起到很重要的作用,且UC患者存在结肠黏膜上皮屏障结构异常导致的屏障功能障碍。本研究通过检测UC患者结肠黏膜IFN-γ、紧密连接蛋白occludin、zo-1及其基因OCLN、ZO-1的表达情况,分析IFN-γ与紧密连接蛋白表达及其与UC临床病理学特征的相关性,探讨UC发病中IFN-γ是否与紧密连接蛋白的异常表达有关,以期更进一步明确UC的发病机制,为寻找新的治疗靶点提供实验依据。材料和方法：选择UC患者40例,其中活动期28例,缓解期12例;20例健康查体者为正常对照组。经结肠内镜活检获得60例新鲜的结肠黏膜标本。从结肠黏膜组织中提取总RNA,应用实时荧光定量反转录pcr (Real-time qRT-pcr)检测结肠黏膜组织中OCLN、ZO-1基因的表达;应用免疫组织化学方法检测结肠黏膜中IFN-γ、 occludin和zo-1的表达及分布。结果： 1IFN-γ在结肠黏膜中的表达 UC患者结肠黏膜组织中IFN-γ的表达较正常对照组明显增高,差异有统计学意义(P0.05)。 2OCLN、ZO-1基因在结肠黏膜中的表达 UC组OCLN、ZO-1基因的表达均明显低于正常对照组,分别是其表达水平的0.285、0.266倍,两组相比,差异有显著统计学意义(P0.05)。 3occludin和zo-1在结肠黏膜中的表达 UC患者结肠黏膜组织中occludin和zo-1的表达均明显低于正常对照组,差异有统计学意义(P0.05)。 4IFN-γ与OCLN、ZO-1基因、occludin及zo-1蛋白表达的相关性分析在UC患者中,IFN-γ的表达水平与OCL、ZO-1基因、occludin及zo-1蛋白的表达水平均呈负相关,相关系数分别为-0.298、-0.325、-0.794、-0.820(P<0.05)。结论： 1、UC患者结肠黏膜组织中紧密连接蛋白occluddi、zo-1及其基因OCL、ZO-1的表达均较正常对照降低,提示在UC中存在结肠黏膜紧密连接蛋白表达的下降,导致肠黏膜屏障功能的减低,因而在UC的发病中起到重要作用。 2、UC患者结肠黏膜组织中IFN-γ的表达较正常对照升高,且与疾病的DAI分级有关,即随着疾病活动度的增加,IFN-γ的表达明显增多。提示IFN-γ与UC发病及疾病的严重程度相关。 3、UC患者结肠黏膜组织中IFN-γ的表达与紧密连接蛋白基因OCLN、ZO-1及其蛋白occludin、zo-1的表达呈负相关性,提示IFN-γ可能通过抑制紧密连接蛋白的表达,导致肠黏膜屏障功能异常而导致UC发病加重。

关键词：溃疡性结肠炎干扰素γ 紧密连接实时荧光定量反转录pcr 免疫组织化学

胃癌中microRNA-375基因高甲基化及表达的研究

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胃癌中microRNA-375基因高甲基化及表达的研究

作者：李阳天津医科大学

学位级别：硕士

目的：胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一,占我国目前恶性肿瘤死亡的第一位。其早期症状不明显并且缺乏有效的治疗措施,因此寻找新的诊断和治疗靶点对胃癌的早期诊断、治疗以及预后具有重要的临床意义。DNA甲基化是调控基因表达的一种重要... 详细信息

目的：胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一,占我国目前恶性肿瘤死亡的第一位。其早期症状不明显并且缺乏有效的治疗措施,因此寻找新的诊断和治疗靶点对胃癌的早期诊断、治疗以及预后具有重要的临床意义。DNA甲基化是调控基因表达的一种重要的表观遗传学过程,在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育及人类肿瘤发生中起着重要作用。肿瘤细胞中DNA甲基化异常概括为基因组整体低甲基化和抑癌基因调控区域高甲基化。MicroRNA (miRNA)是真核生物中一类长度约18-25个碱基的小分子非编码RNA,肿瘤细胞中miRNA的表达受到包括DNA甲基化修饰在内的多种机制的调控,其异常表达与肿瘤的发生、发展及演进有着极为密切的关系。以往的研究表明miRNA-375在胃癌、食管癌等多种肿瘤中低表达,本研究应用生物信息学方法预测其基因启动子区存在CpG岛,通过检测胃癌组织中miRNA-375基因甲基化水平及基因表达水平,探讨其启动子区CpG岛甲基化改变是否参与胃癌组织中miRNA-375异常表达的调控,并进一步预测胃癌中]miRNA-375可能调控的靶基因,为将miRNA基因甲基化作为胃癌早期诊断及治疗的靶点提供依据。方法：1经内镜及手术取90例新鲜组织活检标本,分为两组：胃癌组54例,正常对照组36例。2应用生物信息学进行miRNA-375基因启动子区CpG岛预测并设计甲基化特异性pcr(MSP)引物。提取基因组DNA,应用MSP检测组织1miRNA-375基因启动子区CpG岛甲基化。3提取总RNA,应用实时荧光定量反转录pcr(real-time qRT-pcr)检测组织miRNA-375基因表达。4运用TargetScan Human等生物信息学方法,预测niRNA-375可能的靶基因。结果：1miRNA-375基因甲基化1.1胃癌组织中：miRNA-375基因甲基化胃癌组和正常对照组miRNA-375基因甲基化阳性率分别为62.96%(34/54)和22.22%(8/36),两组相比,差异有统计学意义(P0.05)。2miRNA-375基因表达2.1胃癌组织中miRNA-375基因的表达胃癌组miRNA-375基因的表达低于正常对照组,是其表达水平的0.148倍,两组相比,差异有统计学意义(P0.05)。3生物信息学分析示SP1、AHR、GATA6、KLF4等可能为miRNA-375的靶基因。结论：1预测]miRNA-375基因启动子区存在CpG岛,并证实胃癌组织中存在miRNA-375基因启动子区CpG岛高甲基化,miRNA-375基因高甲基化与胃癌组织分化程度相关。提示miRNA-375基因启动子区甲基化水平检测有助于胃癌早期诊断及预后的判断。2胃癌组织中存在miRNA-375基因异常低表达,且与组织分化程度相关。miRNA-375基因高甲基化可能抑制miRNA-375基因表达,在胃癌发生发展中发挥重要作用。3miRNA-375可能通过调控SP1、AHR、GATA6和KLF4等靶基因的表达参与胃癌的发生发展,为进一步研究胃癌中niRNA-375的作用机制提供依据。

关键词：胃癌 miRNA-375 甲基化基因表达甲基化特异性 pcr 实时荧光定量反转录pcr

末端脱氧核苷酸转移酶介导疾病标志物microRNA检测生物传感器的初步研究

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末端脱氧核苷酸转移酶介导疾病标志物microRNA检测生物传感器的初...

作者：崔警予天津大学

学位级别：硕士

研究表明,micro RNA(mi RNA)在多种癌症的诊断和监测中发挥着重要作用,现已成为研究热点。然而,mi RNA具有序列短、种类多、表达量低等特点,传统的检测技术存在化学修饰复杂、引物设计繁琐和检测成本高昂等缺陷。针对上述问题,本文将末... 详细信息

研究表明,micro RNA(mi RNA)在多种癌症的诊断和监测中发挥着重要作用,现已成为研究热点。然而,mi RNA具有序列短、种类多、表达量低等特点,传统的检测技术存在化学修饰复杂、引物设计繁琐和检测成本高昂等缺陷。针对上述问题,本文将末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)引入到两种生物传感器的开发和设计中,利用TdT无模版依赖聚合、以RNA为引物延伸的DNA聚合酶特性,实现了基因水平疾病标志物mi RNA的高灵敏、高特异检测,主要研究内容如下:(1)基于双酶级联扩增诱导铜纳米粒子自组装新型生物传感器研究。本章利用TdT无模版依赖DNA聚合酶特性,设计了一种基于双酶(TdT/*** QI)级联扩增诱导铜纳米粒子(Cu NPs)自组装新型生物传感器。首先,基于靶标mi RNA序列设计茎环探针和协助探针,该双探针可以特异性识别靶标mi RNA形成稳定DNA三向结构(3-WJ);其次,3-WJ结构触发TdT/*** QI级联扩增以激活Cu NPs自组装,通过检测Cu NPs的荧光强度实现mi RNA精准定量。该方法对帕金森疾病标志物mi RNA153的检测灵敏度可达fmol级别,为mi RNA高灵敏检测及帕金森疾病诊断分析提供了新思路。(2)TdT以RNA为引物延伸特性的初步探究及应用。本章发现TdT以RNA为引物延伸出长链DNA,基于此特性,设计了一种新型mi RNA生物传感器,有效解决了mi RNA序列短导致的引物设计复杂等技术难题。以TdT在mi RNA3’-OH末端延伸出的长链DNA为模版,设计随机序列茎环引物和特异性直链引物进行实时荧光定量反转录pcr扩增(RT-q pcr),构建一种引物设计简单、无需复杂修饰的mi RNA通用型检测方法并成功应用于肝损伤标志物mi RNA122的检测。综上所述,本文基于TdT成功构建了两种生物传感器并将其应用于实际样本检测,拓展了TdT的应用前景,为疾病标志物的检测提供了新策略。

关键词：铜纳米粒子 MicroRNA检测末端脱氧核苷酸转移酶 Nt.BspQI切刻酶 DNA三向结构实时荧光定量反转录pcr

从生食鱼肉中提取GII型诺如病毒的不同方法的比较

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中国食品卫生杂志 2016年第6期28卷 753-758页

作者：范一灵杨美成杨燕上海市食品药品检验所上海201203

目的本研究比较了多种可能适用于生食水产鱼肉中诺如病毒(No V)的提取方法。方法人工污染GII型No V三文鱼肉样品,通过病毒洗脱、浓缩、核酸提取,以及实时荧光定量反转录-聚合酶链式反应(RT-q pcr)检测等步骤的比较和优化,提高样品中No ... 详细信息

目的本研究比较了多种可能适用于生食水产鱼肉中诺如病毒(No V)的提取方法。方法人工污染GII型No V三文鱼肉样品,通过病毒洗脱、浓缩、核酸提取,以及实时荧光定量反转录-聚合酶链式反应(RT-q pcr)检测等步骤的比较和优化,提高样品中No V的检测成功率和回收率。结果采用Tri/Glycine/Beef extract缓冲溶液洗脱、PEG/Na Cl溶液沉降、增加氯仿-正丁醇(1∶1,V/V)溶液萃取等步骤,可以有效富集样品中的No V,并有效去除样品中的pcr抑制成分。优化后的检测方案可以将人工污染GII型No V的鱼肉样品的回收率由不足3%提高至15.15%,检测灵敏度可以达到17.3 RT-pcrU/25 g。结论优化后的病毒提取方法具有良好的耐用性和重现性,适合于生食水产鱼肉中No V的快速检测。

关键词：诺如病毒提取鱼肉生食水产品实时荧光定量反转录pcr 回收率检测

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持家基因作为相对定量内标物的稳定性比较

生物技术通讯 2006年第5期17卷 807-809页

作者：朱芷葳董常生山西农业大学动物科技学院山西太谷030801

定量pcr是在pcr定性技术基础上发展起来的核酸定量技术,定量检测时常用编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶、β-肌动蛋白、28S和18SrRNA等的持家基因作为内部参照,这些基因被认为在某些类型细胞中的表达是恒定的。近年来,很多研究者发现上述持家... 详细信息

定量pcr是在pcr定性技术基础上发展起来的核酸定量技术,定量检测时常用编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶、β-肌动蛋白、28S和18SrRNA等的持家基因作为内部参照,这些基因被认为在某些类型细胞中的表达是恒定的。近年来,很多研究者发现上述持家基因的表达水平并不稳定,利用它们作为内标来定量并不准确。因此,在进行定量实验时应选择适当的2种或2种以上的内参基因,以减少检测标本间的差异。

关键词：实时荧光定量反转录pcr 持家基因定量检测