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基于定点突变的植物Ⅲ型聚酮合酶结构与功能研究进展

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生物工程学报 2018年第4期34卷 473-488页

作者：李星陈默柴团耀王红中国科学院大学北京100049 中国科学院遗传与发育生物学研究所北京100101

植物Ⅲ型聚酮合酶(Polyketide synthases,PKSs)催化形成一系列结构迥异、生理活性不同的聚酮类化合物的基本骨架结构,是聚酮类化合物生物合成途径的关键酶。目前已从植物中克隆和鉴定了多种功能不同的Ⅲ型PKSs。定点突变技术是研究蛋白... 详细信息

植物Ⅲ型聚酮合酶(Polyketide synthases,PKSs)催化形成一系列结构迥异、生理活性不同的聚酮类化合物的基本骨架结构,是聚酮类化合物生物合成途径的关键酶。目前已从植物中克隆和鉴定了多种功能不同的Ⅲ型PKSs。定点突变技术是研究蛋白质结构与功能之间复杂关系的重要方法。文中综述了近年来基于定点突变的植物Ⅲ型PKSs结构与功能关系的研究进展,包括利用定点突变技术修饰各种可能影响植物Ⅲ型PKSs结构的氨基酸残基,来研究其对功能的影响(如控制起始底物的特异性、缩合反应次数以及中间产物环化方式),以期为植物Ⅲ型PKSs结构与功能关系的研究提供参考。

关键词：聚酮类化合物植物Ⅲ型聚酮合酶结构与功能定点突变

利用定点突变分析白念珠菌依赖铁基因FRP1启动子元件

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生物工程学报 2008年第8期24卷 1348-1353页

作者：桂磊梁勇魏东盛郑雯邢来君李明春南开大学微生物学系分子微生物学与技术教育部重点实验室天津300071

通过对白念珠菌高铁还原酶基因FRP1启动子进行突变分析,确认启动子中特殊调控元件。我们通过分析FRP1起始密码子上游1000bp序列发现在-160和-650处有2个推测的Rim101p结合位点,对其分别进行定点突变,然后构建启动子与报告基因LacZ融合质... 详细信息

通过对白念珠菌高铁还原酶基因FRP1启动子进行突变分析,确认启动子中特殊调控元件。我们通过分析FRP1起始密码子上游1000bp序列发现在-160和-650处有2个推测的Rim101p结合位点,对其分别进行定点突变,然后构建启动子与报告基因LacZ融合质粒,转化整合到白念珠菌rim101-/-株和野生株中,检测不同缺铁条件下β-半乳糖苷酶活性。结果发现碱性条件,Rim101p能够正向调控FRP1的表达;启动子-160处突变对启动子功能影响较弱,而-650突变使启动子活性大大降低,此结果和双突变的结果相同,表明Rim101p主要通过与启动子-650处结合位点相互作用来调控FRP1的表达。

关键词：定点突变白念珠菌 Rim101蛋白高铁还原酶基因

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溶葡球菌酶的定点突变与PEG巯基定点修饰

生物工程学报 2011年第11期27卷 1623-1630页

作者：吴宏房伟袁璟彭惠张学成王永中肖亚中安徽大学生命科学学院安徽省微生物与生物催化工程技术研究中心合肥230039

为了建立聚乙二醇(PEG)巯基定点修饰溶葡球菌酶的方法,并检验假定连接区的突变与修饰对酶活的影响,对溶葡球菌酶的假定连接区进行了巯基聚乙二醇定点修饰研究。通过分析溶葡球菌酶的结构特征,选择两个结构域之间的氨基酸(133-154aa)进... 详细信息

为了建立聚乙二醇(PEG)巯基定点修饰溶葡球菌酶的方法,并检验假定连接区的突变与修饰对酶活的影响,对溶葡球菌酶的假定连接区进行了巯基聚乙二醇定点修饰研究。通过分析溶葡球菌酶的结构特征,选择两个结构域之间的氨基酸(133-154aa)进行定点突变引入半胱氨酸残基。使用单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(mPEG-MAL)进行定点修饰,对修饰后的酶进行纯化并测定酶活性。结果表明定点突变的半胱氨酸残基PEG修饰效率高、产物单一,运用简便的Ni2+-NTA柱亲和层析法实现了一步分离,获得了高纯度的目标蛋白,但在连接区进行定点突变及PEG定点修饰后的酶活有不同程度的降低,表明假定连接区部分位点的PEG修饰会对溶葡球菌酶的催化活性产生一定影响。

关键词：溶葡球菌酶定点突变 PEG巯基定点修饰

理性设计定点突变提高Streptomyces kathirae SC-1酪氨酸酶热稳定性

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食品与生物技术学报 2017年第9期36卷 906-911页

作者：郭静饶志明杨套伟满在伟张显徐美娟李星江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

利用SWISS-MODEL在线服务器以栗色浑圆链霉菌(Streptomyces castaneoglobisporus)酪氨酸酶(PDB登录号:2AHL)为模板对***酪氨酸酶的3-D结构进行同源模拟。使用在线预测软件PoPMuSiC-2.1计算酪氨酸酶每个突变氨基酸的去折叠自由能变化(Δ... 详细信息

利用SWISS-MODEL在线服务器以栗色浑圆链霉菌(Streptomyces castaneoglobisporus)酪氨酸酶(PDB登录号:2AHL)为模板对***酪氨酸酶的3-D结构进行同源模拟。使用在线预测软件PoPMuSiC-2.1计算酪氨酸酶每个突变氨基酸的去折叠自由能变化(ΔΔG)来辅助设计提高酪氨酸酶的稳定性,利用定点突变构建突变体,并且在大肠杆菌中对野生型酪氨酸酶及突变体进行表达,最终获得了两个热稳定性提高的突变体R95Y、G123W。在此基础上进行复合突变,获得了一个热稳定性显著提高的突变体R95Y/G123W。该突变体在60℃的半衰期提高了2.43倍,最适反应温度由45℃提高到50℃,本研究所用的基于蛋白质结构的理性设计提高稳定性的策略也可以应用于其他工业酶类,显示了良好的应用前景。

关键词：酪氨酸酶氢键定点突变热稳定性理性设计 POPMuSiC

细菌CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因定点突变对酶活性的影响研究

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中国抗生素杂志 2008年第4期33卷 232-234,246页

作者：陈大斌谢勇恩凌保东周岐新张翔雷军重庆医科大学药理学教研室重庆400016 川北医学院药物研究所南充637007

目的构建CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因突变体,比较突变前、后酶活性的变化,进一步阐明酶的分子结构特征和生化特性。方法利用重叠延伸PCR定点诱变技术将CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因Ser240(丝氨酸)AGC定点突变为Gly240(甘氨酸)GGC,分... 详细信息

目的构建CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因突变体,比较突变前、后酶活性的变化,进一步阐明酶的分子结构特征和生化特性。方法利用重叠延伸PCR定点诱变技术将CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因Ser240(丝氨酸)AGC定点突变为Gly240(甘氨酸)GGC,分别构建CTX-M型酶的原核重组表达载体及其突变表达载体,重组载体经酶切鉴定和DNA测序鉴定后,转化大肠埃希菌JM109,比较突变前、后酶活性的改变。结果酶切鉴定和DNA测序鉴定表明CTX-M型酶的原核重组表达载体及其突变表达载体构建成功,转化大肠埃希菌JM109后,发现含野生型CTX-M基因的重组菌其酶活性与来源菌株相近,而含突变型CTX-M基因的重组菌未检测到酶活性。结论Ser240对于维持CTX-M型超广谱β-内酰胺酶活性具有重要作用。

关键词：超广谱β-内酰胺酶 CTX-M基因定点突变酶活性

苏云金芽孢杆菌Cry1Ca7蛋白定点突变对甜菜夜蛾杀虫活性的影响

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微生物学报 2008年第6期48卷 733-738页

作者：任羽刘华梅宋福平黄大昉张杰中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室北京100094 中国农业科学院生物技术研究所北京100081

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ca7对重要的农业害虫甜菜夜蛾具有较高毒力。【目的】本文的研究目的是通过定点突变的方法获得毒力发生改变的毒蛋白,为下一步研究工作提供有价值的实验材料。【方法】利用重叠引物PCR技术对cry1Ca7基因... 详细信息

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ca7对重要的农业害虫甜菜夜蛾具有较高毒力。【目的】本文的研究目的是通过定点突变的方法获得毒力发生改变的毒蛋白,为下一步研究工作提供有价值的实验材料。【方法】利用重叠引物PCR技术对cry1Ca7基因进行定点突变,获得了10种突变基因,通过生物活性测定的方法确定了各突变基因表达产物对甜菜夜蛾的杀虫活性。【结果】活性降低的突变毒蛋白有G138S,T221D,T221R,N251S,439GGT440,N306R,W376F,R522E和R570G,其中,位于DomainⅡ内的突变的活性依次是439GGT440突变R522E突变毒蛋白,其毒性较Cry1Ca7提高了6倍,而同样位于DomainⅠ内的突变T221D突变更容易产生活性提高的突变蛋白,而结构域Ⅱ和Ⅲ较难获得毒力提高的突变蛋白。【结论】本项研究所获得的这些活性发生不同变化的蛋白为揭示Cry蛋白的杀虫机理提供了基础材料,而活性提高的诱变基因及其表达产物将可作为新的杀虫资源,用于抗虫遗传工程菌和转基因植物的构建。

关键词：苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白定点突变 cry1Ca7基因甜菜夜蛾

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定点突变改造棒状链霉菌青霉素扩环酶

江苏农业科学 2013年第8期41卷 53-54页

作者：季俊杰张红梅中国矿业大学(北京)化学与环境工程学院北京100083 中国科学院大学北京100049

利用定点突变技术对ScDAOCS进行改造,得到3个突变体Q166E、D28E、M73I,生物活性检测和比活力数据表明2个突变体D28E、M73I的催化活性提高,为7-ADCA的合成提供了技术支持。

关键词：定点突变青霉素扩环酶棒状链霉菌

人IL-29定点突变体抗肿瘤细胞增殖活性分析

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食品与生物技术学报 2017年第5期36卷 553-559页

作者：李利云陆源葛春蕾彭荣刚李昕哲谭敬陈永康陈伟江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学药学院江苏无锡214122 江南大学无锡医学院江苏无锡214122

为分析人白细胞介素-29(h IL-29)变异体抗肿瘤细胞增殖活性,采用大引物PCR方法对人h IL-29基因第104位碱基进行点突变,使h IL-29肽链第35位Arg定点改造为Lys。得到的h IL-29变异体基因经重组后转化毕赤酵母GS115和诱导表达,经纯化获得... 详细信息

为分析人白细胞介素-29(h IL-29)变异体抗肿瘤细胞增殖活性,采用大引物PCR方法对人h IL-29基因第104位碱基进行点突变,使h IL-29肽链第35位Arg定点改造为Lys。得到的h IL-29变异体基因经重组后转化毕赤酵母GS115和诱导表达,经纯化获得重组蛋白rh IL-29mut35。SDS-PAGE分析显示rh IL-29mut35的相对分子质量约23×103,Western Blotting鉴定显示其与羊抗人IL-29多克隆抗体发生特异性结合反应。用CCK-8试剂检测rh IL-29mut35对肿瘤细胞增殖的影响,rh IL-29mut35在不同质量浓度时对胃癌细胞SGC7901、肝癌细胞BEL7402、肺腺癌细胞A549和结肠癌细胞HCT8的增殖均有抑制作用,高剂量组(1 000 ng/m L)rh IL-29mut35对胃癌细胞SGC7901、肝癌细胞BEL7402、肺腺癌细胞A549和结肠癌细胞HCT8增值的抑制率分别为(34.20±1.50)%、(27.30±0.31)%、(30.20±0.68)%、(29.13±1.40)%,与阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。而且高剂量组的抗增殖效应高于野生型rh IL-29的(P<0.01),这为进一步研制开发IL-29的抗肿瘤药物奠定基础。

关键词：人白细胞介素-29 定点突变重组蛋白抗肿瘤活性

分子模拟对接和定点突变提高10β–去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰氧基转移酶的活力

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华南农业大学学报 2018年第5期39卷 87-92页

作者：欧阳萍兰黄佳俊林淑玲魏韬林俊芳郭丽琼刘俊峰刘绮倩华南农业大学食品学院广东广州510642 广东省微生态制剂工程技术研究中心广东广州510640

【目的】提高10β–去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰氧基转移酶(DBAT)活力,从而更高效地体外酶促合成巴卡亭Ⅲ。【方法】通过DBAT与其天然底物乙酰Co A的计算机分子模拟对接,选定C165W、N300I、F160C 3个氨基酸残基进行单点定点突变。突变基因经大... 详细信息

【目的】提高10β–去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰氧基转移酶(DBAT)活力,从而更高效地体外酶促合成巴卡亭Ⅲ。【方法】通过DBAT与其天然底物乙酰Co A的计算机分子模拟对接,选定C165W、N300I、F160C 3个氨基酸残基进行单点定点突变。突变基因经大肠埃希菌重组表达,突变重组酶特性经体外酶促反应测定。【结果】3种突变重组酶的相对分子质量为67 000;最适反应温度均为32.5℃,与野生酶DBAT一致;DBAT^(F160C)与DBAT的最适反应pH为7.5,略高于DBAT^(C165W)和DBAT^(N300I)的最适反应pH(7.0);DBAT^(C165W)、DBAT^(F160C)和DBAT^(N300I)的比活力与DBAT相比分别提高了61.5%、59.6%和19.2%,催化效率分别提高了55.4%、35.1%和2.9%,3种突变酶的米式常数(K_m)和最大反应速率(v_(max))均高于DBAT。【结论】疏水突变导致突变酶的比活力相比野生型均有显著提高,研究结果为体外高效酶促合成紫杉醇化学半合成的直接前体物巴卡亭Ⅲ奠定了基础。

关键词： 10β–去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰氧基转移酶分子模拟对接定点突变比活力酶促反应巴卡亭Ⅲ