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奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素cDNA的原核表达及其免疫原性研究

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生物工程学报 2006年第4期22卷 561-566页

作者：丁炜东曹丽萍吴婷婷中国水产科学研究院淡水渔业研究中心农业部水生动物遗传育种和养殖生物学重点开放实验室无锡214081

促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasinghormone,GnRH)是下丘脑分泌产生的神经激素,对脊椎动物生殖的调控起重要作用。为研究GnRH对奥利亚罗非鱼性腺发育的作用,构建了GnRHcDNA的原核表达载体并进行融合表达。利用RT-PCR方法从丘脑... 详细信息

促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasinghormone,GnRH)是下丘脑分泌产生的神经激素,对脊椎动物生殖的调控起重要作用。为研究GnRH对奥利亚罗非鱼性腺发育的作用,构建了GnRHcDNA的原核表达载体并进行融合表达。利用RT-PCR方法从丘脑中扩增出长约400bp的目的序列GnRH基因,克隆至T载体中,经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后将此片段克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH,并在大肠杆菌TB1中获得了高表达,目的蛋白约占菌体总蛋白的41.6%。菌体经溶菌酶裂解,制备无细胞抽提液,Amylose-sepharose柱层析后得到分子量为56kD单一条带的目的蛋白。目的蛋白经FactorXa酶切裂解,Amylose-sepharose过柱纯化后得到纯化的GnRH前体蛋白。以80μg/只的剂量4次免疫ICR小鼠,免疫小鼠可以检测到特异性针对GnRH前体蛋白的血清抗体应答,免疫组抗体水平显著高于空白组(P<0.05),且加强免疫第5周后抗体效价为0.707±0.320,达到高峰值,说明表达产物具有免疫原性,可以刺激机体产生免疫应答。

关键词：奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素促性腺激素释放激素相关肽原核表达抗体免疫原性

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奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼核型及DNA含量的比较研究

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东北林业大学学报 1995年第1期23卷 46-51页

作者：尹洪滨范兆廷潘峰孙中武黑龙江水产研究所中国水产科学研究所淡水渔业研究中心东北林业大学

采用ＰＨＡ体内培养法，取鱼体肾细胞用空气干燥法制备奥利亚罗非鱼（Ｓａｒｏｔｈｅｒｏｄｏｎａｕｒｅａ）和尼罗罗非鱼（Ｓ．ｎｉｌｏｔｉｃａ）的染色体，经核型分析，奥利亚罗非鱼为２ｎ＝４４，６ｓｍ＋２４ｓｔ＋１４ｔ；ＮＦ＝... 详细信息

采用ＰＨＡ体内培养法，取鱼体肾细胞用空气干燥法制备奥利亚罗非鱼（Ｓａｒｏｔｈｅｒｏｄｏｎａｕｒｅａ）和尼罗罗非鱼（Ｓ．ｎｉｌｏｔｉｃａ）的染色体，经核型分析，奥利亚罗非鱼为２ｎ＝４４，６ｓｍ＋２４ｓｔ＋１４ｔ；ＮＦ＝５０。尼罗罗非鱼为２ｎ＝４４，６ｓｍ＋２４ｓｔ＋１４ｔ；ＮＦ＝５０。经流式细胞仪测量外周血红血球的ＤＮＡ含量，奥利亚罗非鱼为２Ｃ＝２．２２ｐｇ（２．２２ｐｇ／Ｎｕｃｌ．）；尼罗罗非鱼为２Ｃ＝２．２７ｐｇ（２．２７ｐｇ／Ｎｕｃｌ．）。经对比分析，两种鱼的核型和ＤＮＡ含量之间的差异不显著，在分类地位上非常接近。

关键词：罗非鱼奥利亚罗非鱼尼罗罗非鱼染色体 DNA

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奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼MyoD1和MyoD2基因特征及差异

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中国水产科学 2010年第5期17卷 903-912页

作者：卢中华俞菊华李红霞李建林唐永凯阮瑞霞杨光南京农业大学无锡渔业学院中国水产科学研究院淡水渔业研究中心农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室上海海洋大学水产与生命学院

采用RT-PCR和RACE法,分离了奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)、尼罗罗非鱼(***)MyoD1和MyoD2基因全长cDNA。结果显示,2种罗非鱼MyoD1全长均为1090bp,包括5′非翻译区(UTR)137bp,3′UTR50bp,开放阅读框(ORF)903bp,编码300个氨基酸,其中第110～161个氨基酸为bHLH结构,第233～249个氨基酸为helixIII结构;MyoD2全长均为1478bp,包括5′UTR215bp,3′UTR471bp,ORF792bp,编码263个氨基酸,其中第91～142个氨基酸为bHLH结构,第212～228个氨基酸为helixIII结构。2种罗非鱼MyoD1与其他鱼类MyoD1的相似性为73%～92%;MyoD2与其他鱼类MyoD2的相似性为74%～79%。系统发育树显示,MyoD1和MyoD2分属两支,MyoD1所反映的不同鱼类间的亲缘关系符合传统分类。2种罗非鱼的MyoD1、MyoD2cDNA序列之间只存在个别碱基的差别,而氨基酸序列一致;奥利亚罗非鱼MyoD1的2个内含子均比尼罗罗非鱼的长。根据MyoD1内含子2的差异构建鉴别奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼基因混杂的标记,对形态上典型的15尾奥利亚罗非鱼、18尾尼罗罗非鱼及15尾奥尼罗非鱼[Oreochromis aureus(♂)×Oreochromis niloticus(♀)]进行鉴定。结果其中1尾奥利亚罗非鱼中在MyoD1位点混杂了尼罗罗非鱼的基因,尼罗罗非鱼和奥尼罗非鱼则与预期的一致。该研究为选择基因纯合的奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼提供了新的分子手段。

关键词：奥利亚罗非鱼尼罗罗非鱼 MyoD1基因 MyoD2基因基因特征基因差异

奥利亚罗非鱼3种C型溶菌酶基因的克隆及其序列分析

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农业生物技术学报 2010年第1期18卷 66-74页

作者：禹绍国叶星张莉莉田园园劳海华白俊杰卢迈新中国水产科学研究院珠江水产研究所上海海洋大学广东海洋大学

本研究结合RT-PCR和RACE法获得了奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)三种C型溶菌酶基因C-1,C-2和C-3的全长cDNA。3个基因的cDNA分别为581bp、662bp和695bp,各编码143、156和143个氨基酸(GenBank accession No:EU913095,EU913094和EU836689),相互间氨基酸序列的同源性在63.9%～67.8%之间。3个基因均具有与其它物种C型溶菌酶相同的8个保守半胱氨酸残基和2个活性位点Glu35和Asp52,可认为它们均为C型溶菌酶基因。在系统进化树中这3个基因首先与同属高等真骨鱼类的聚类,最后再与低等真骨鱼类的聚类,系统进化关系与传统鱼类分类地位相吻合,显示真骨鱼类C型溶菌酶的进化速度与物种的进化速度基本一致。蛋白分析软件分析显示这3个基因均具有C型溶菌酶的典型结构、相似的蛋白二、三级结构,推测应具有与C型溶菌酶相似的生理功能。但3个基因氨基酸序列间存在一定差异,其中C-1的等电点较低且碱性氨基酸较少,因此3种溶菌酶可能具有生理功能上的差异与分工。

关键词：奥利亚罗非鱼 C型溶菌酶蛋白质高级结构

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奥利亚罗非鱼AMH基因结构及其表达

水产学报 2009年第3期33卷 379-388页

作者：唐永凯李建林俞菊华中国水产科学研究院淡水渔业研究中心农业部水生动物遗传育种和养殖生物学重点开放实验室

抗缪勒氏管激素(anti-Mullerian hormone,AMH),也称缪勒氏管抑制物质(mullerianinhibiting substance,MIS),为肽类生长因子,属于TGF-β生长和分化因子家族。应用RT-PCR和RACE法,从奥利亚罗非鱼精巢组织中分离出AMH的cDNA。分离到3′UTR长为621 bp和168 bp的两条cDNA,除了长度不一,两者之间只存在两个碱基的差别。5′UTR为27 bp,阅读框为1 545 bp,翻译成514个氨基酸,其中,AMH-N域237个氨基酸,TGF-β域93个氨基酸。同源性分析显示,AMH保守性偏低,奥利亚罗非鱼与其它鱼类的相似性为32%~60%,与哺乳类动物只有19%~21%,而TGF-β域的保守性相对较高,与其它鱼类的相似性为54%~72%。基因结构分析显示,奥利亚罗非鱼AMH存在6个内含子,和斑马鱼AMH结构相似,和人、鼠AMH有较大差别,它们缺少奥利亚罗非鱼和斑马鱼AMH基因共有的内含子Ⅰ和Ⅵ。然而,启动子转录因子分析结果表明,奥利亚罗非鱼AMH启动子中也存在SRY,SF-1,GATA-4,Sox5,Sox9等结合位点。使用Taqman探针分析奥利亚罗非鱼AMH在成鱼不同组织中的表达以及鱼苗、鱼种、成鱼性腺中的表达量,结果显示AMH在成鱼的卵巢、精巢中均有表达,而在脑、肝、肌肉以及心脏中不表达。AMH在鱼苗性腺中不表达,在鱼种、成鱼中雄鱼AMH表达量显著高于雌鱼,而鱼种雄鱼AMH表达量是成鱼雄鱼的10倍。

关键词：奥利亚罗非鱼抗缪勒氏管激素快速扩增cDNA末端内含子启动子 Taqman探针

奥利亚罗非鱼EF-1α基因的克隆与结构分析

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动物学杂志 2008年第5期43卷 7-12页

作者：唐永凯李建林李红霞陈雪峰俞菊华中国水产科学研究院淡水渔业研究中心农业部水生动物遗传育种和养殖生物学重点开放实验室无锡214081 南京农业大学南京210095

真核生物延伸生长因子基因(EF-1α)在蛋白质翻译过程中起着重要的作用,其序列具有高度的保守性,是一种管家基因。本文通过RT-PCR克隆出奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)EF-1α的部分cDNA序列,其长度为425bp,翻译成141个氨基酸,计算的... 详细信息

真核生物延伸生长因子基因(EF-1α)在蛋白质翻译过程中起着重要的作用,其序列具有高度的保守性,是一种管家基因。本文通过RT-PCR克隆出奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)EF-1α的部分cDNA序列,其长度为425bp,翻译成141个氨基酸,计算的蛋白质分子量为15.1ku。同源性分析显示,奥利亚罗非鱼EF-1α氨基酸序列与尼罗罗非鱼(***)的相似性最高,为100%;与青(鱼将)(Oryzias latipes)、欧洲鲈(Dicentrarchus labrax)、斑马鱼(Danio rerio)、鲑鱼(Salmo trutta)的相似性分别为92%、91%、85%、82%;与小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、人(Homo sapiens)、鸡(Gallus gallus)的相似性均为85%。同时克隆出奥利亚罗非鱼EF-1α相应的DNA序列,共506bp。cDNA与DNA的序列比对显示克隆出的奥利亚罗非鱼EF-1α含有1个内含子,这为将来设计EF-1α荧光定量引物以及测定其在不同组织中的表达量变化打下基础。

关键词：奥利亚罗非鱼克隆 EF-1α

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奥利亚罗非鱼雌激素β受体两种亚型cDNA的克隆、组织分布及雌激素对其表达的影响

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水产学报 2010年第1期34卷 8-18页

作者：兰滔卢迈新杨丽萍叶星朱华平高风英黄樟翰中国水产科学研究院珠江水产研究所广东海洋大学水产学院

采用RT-PCR和RACE技术,克隆了奥利亚罗非鱼β雌激素受体基因(estrogen receptorβ,ERβ)两种亚型的cDNA全序列(ERβ1和ERβ2)。荧光定量PCR分析雌雄奥利亚罗非鱼两种亚型的组织分布,并观察注射外源雌激素对雄性奥利亚罗非鱼下丘脑-垂体... 详细信息

采用RT-PCR和RACE技术,克隆了奥利亚罗非鱼β雌激素受体基因(estrogen receptorβ,ERβ)两种亚型的cDNA全序列(ERβ1和ERβ2)。荧光定量PCR分析雌雄奥利亚罗非鱼两种亚型的组织分布,并观察注射外源雌激素对雄性奥利亚罗非鱼下丘脑-垂体-性腺轴雌激素受体ERα和β(β1/β2)基因表达的影响。序列分析表明,ERβ1cDNA全长为4262bp,其中包含239bp5′非编码区,2349bp3′非编码区和1674bp的开放阅读框,共编码557个氨基酸。ERβ2 cDNA全长为2506bp,包含5′非编码区393bp,3′非编码区109bp,阅读框为2004bp,共编码667个氨基酸。氨基酸序列同源性分析显示奥利亚罗非鱼ERβ1与尼罗罗非鱼的相似性高达99.1%,而与鲈形目其它鱼类的相似性为82.6%～94.2%。ERβ2氨基酸序列与尼罗罗非鱼的相似性为98.7%,与大口黑鲈、虹鳟、底鳉及斑马鱼的相似性分别为81.8%、76.3%、64.7%和55.0%。在系统进化树上奥利亚罗非鱼的ERβ1和ERβ2分别与尼罗罗非鱼的相应受体聚类。奥利亚罗非鱼ERβ1/β2基因在所检测的10种组织中均有表达。ERβ1基因在卵巢、精巢、肝脏、肾脏和肠等组织的表达量均显著高于其他组织(P奥利亚罗非鱼下丘脑ERα/β1基因的表达上调,其中以ERα的升幅最大,且存在剂量依赖效应。在E2高剂量组(7.5mg/kg)下丘脑ERα的表达量显著升高(P奥利亚罗非鱼3种ER亚型存在着不同的生理功能。

关键词：奥利亚罗非鱼 β雌激素受体 ERβ1和ERβ2 组织分布表达调控

奥利亚罗非鱼DMO和DMT基因的时空表达特征分析

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水产学报 2007年第2期31卷 129-136页

作者：曹谨玲俞菊华曹哲民李建琳吴婷婷南京农业大学无锡渔业学院中国水产科学研究院淡水渔业研究中心农业部水生动物遗传育种和养殖生物学重点开放实验室中国水产科学研究院淡水渔业研究中心农业部水生动物遗传育种和养殖生物学重点开放实验室江苏无锡214081

采用荧光定量RT-PCR方法对奥利亚罗非鱼DMO和DMT基因的时空表达进行了研究。结果发现,这两个基因均从原肠胚早期开始转录,一直到出膜,都维持着较高的表达水平,但DMO表达量明显高于DMT。从鱼苗孵化出膜的第1天开始,随着日龄的增加,DMO和... 详细信息

采用荧光定量RT-PCR方法对奥利亚罗非鱼DMO和DMT基因的时空表达进行了研究。结果发现,这两个基因均从原肠胚早期开始转录,一直到出膜,都维持着较高的表达水平,但DMO表达量明显高于DMT。从鱼苗孵化出膜的第1天开始,随着日龄的增加,DMO和DMT基因的表达量均增加,但DMO在性腺和脑中都能表达,而DMT则仅在精巢中专一性表达。鱼苗性腺分化时期,也可影响DMO和DMT基因的表达量,提示它们可能与激素调控有关。在雌、雄鱼的肝和肾等5种组织中均检测不到这两个基因转录本的存在;在脑中仅可检测到DMO基因不同强弱的转录本,呈现出很强的中枢神经系统的表达特异性。此外,在成体的卵巢和精巢中分别只可检测到DMO和DMT基因的大量表达,显示二者在性别决定和分化中的重要功能。奥利亚罗非鱼DMO基因在其中枢神经系统发育及卵巢发生和功能维持上有着重要功能;DMT基因在精巢发生和功能维持上起重要作用。

关键词：奥利亚罗非鱼 DMO DMT 时空表达荧光定量

奥利亚罗非鱼(♀)×鳜(♂)远缘杂交子代与亲本血液学指标的比较

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中国水产科学 2008年第5期15卷 766-772页

作者：王金龙杨弘吴婷婷湖南省水产科学研究所中国水产科学研究院淡水渔业中心农业部水生动物遗传育种和养殖生物学重点开放实验室

本研究对奥利亚罗非鱼(Oreochromis aurea)(♀)×鳜(Siniperca chuatsi)(♂)远缘杂交子代(F2和F3)与双亲的血液常规参数和血液生化指标进行了比较,探讨杂交对子代血液学指标的影响。杂交子代具有两种来源,第一种的杂交母本为中心奥利亚... 详细信息

本研究对奥利亚罗非鱼(Oreochromis aurea)(♀)×鳜(Siniperca chuatsi)(♂)远缘杂交子代(F2和F3)与双亲的血液常规参数和血液生化指标进行了比较,探讨杂交对子代血液学指标的影响。杂交子代具有两种来源,第一种的杂交母本为中心奥利亚罗非鱼(子代简称中心奥利亚杂交);另一种的母本为埃及奥利亚罗非鱼(子代简称埃及奥利亚杂交)。用于对照实验的母本为中心奥利亚罗非鱼。结果显示,中心奥利亚杂交F2与对照母本F2在2个血液常规参数和1个血液生化指标上存在显著差异(P奥利亚杂交F3与对照母本F3在4个血液常规参数和2个血液生化指标上存在着显著差异(P奥利亚杂交F2与对照母本F2在4个血液常规参数和4个血液生化指标上存在着显著差异(P奥利亚杂交F3与对照母本F3在2个血液常规参数和3个血液生化指标上存在显著差异(P<0.05),与父本鳜则有7个参数和3个血液生化指标具有显著差异(P<0.05)。不同品系来源的杂交后代中,2个F2群体在1个血常规参数和1个血液生化指标上具有显著差异(P<0.05),而2个F3群体仅1个血液生化指标具有显著差异(P<0.05)。研究结果表明,杂交子代与双亲在血液组成上均存在差异,但其更接近于母本。这些差异可能是由于杂交所引起的遗传结构变化所致。

关键词：远缘杂交奥利亚罗非鱼鳜子代血液学