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太平洋鳕线粒体全基因组测序及结构特征分析

水生生物学报 2019年第1期43卷 17-26页

作者：毛明光顾杰刘瑞婷陈雨吴玲梅姜志强蒋洁兰大连海洋大学农业农村部北方海水增养殖重点实验室大连116023 中国科学院水生生物研究所武汉430072

通过二代基因测序技术获得太平洋鳕(Gadus macrocephalus)线粒体基因组全序列,对线粒体基因进行了注释,对其序列结构进行了分析。研究结果表明,太平洋鳕线粒体基因组全长16569 bp,共编码13个蛋白质,并且包含了22个tRNA, 2个rRNA以及1个D... 详细信息

通过二代基因测序技术获得太平洋鳕(Gadus macrocephalus)线粒体基因组全序列,对线粒体基因进行了注释,对其序列结构进行了分析。研究结果表明,太平洋鳕线粒体基因组全长16569 bp,共编码13个蛋白质,并且包含了22个tRNA, 2个rRNA以及1个D-Loop区。碱基组成存在明显的AT偏向和弱AT负偏斜现象。太平洋鳕线粒体在蛋白质编码基因中共有5种终止密码子,包含哺乳动物线粒体常见终止密码子AGG与AGA。除tRNA-Ser(GCT)基因缺失二氢尿嘧啶臂(DHU臂)外,其余tRNA均能形成典型的三叶草结构。D-Loop区只存在与终止结合序列区(Terminal associated sequences, TAS)和保守序列框(Conserved sequences blocks, CSB)功能类似的序列,并且出现17 bp的嘧啶序列。非编码区含有一段保守的控制轻链复制起始的序列(OL)及一段74 bp的基因间隔区。基于线粒体基因组全序列和Cytb基因,分别构建了鳕形目下几种鳕的进化树,结果为揭示太平洋鳕进化地位提供了重要依据。

关键词：太平洋鳕线粒体基因组系统进化 AT偏移

太平洋鳕(Gadusmacrocephalus)亲鱼驯化培育与早期发育特征

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渔业科学进展 2017年第1期38卷 159-167页

作者：徐永江柳学周史宝王滨农业部海洋渔业可持续发展重点实验室青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛266071 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室青岛266071

采捕山东威海外海黄海海域的太平洋鳕(Gadus macrocephalus)亲鱼进行驯化和培育,在人工条件下成功驯化存活野生亲鱼49尾,经短期促熟培育后,通过人工授精方式获得了多批次受精卵。对胚胎和早期仔鱼发育过程进行了观察,详细描述了从受精... 详细信息

采捕山东威海外海黄海海域的太平洋鳕(Gadus macrocephalus)亲鱼进行驯化和培育,在人工条件下成功驯化存活野生亲鱼49尾,经短期促熟培育后,通过人工授精方式获得了多批次受精卵。对胚胎和早期仔鱼发育过程进行了观察,详细描述了从受精卵到早期仔鱼各发育时期的形态特征。结果显示,太平洋鳕成熟卵子为沉性卵,圆球形,卵径为0.9–1.1 mm,无油球。胚胎发育分为5个时期,分别为卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期和器官形成期。在水温为9–10℃、盐度为27–29的海水中孵化,受精卵历时312 h 30 min孵化出膜。初孵仔鱼全长为(3.85?0.12)mm,6日龄仔鱼开口,肛门与外界相通,进入混合营养期。8日龄仔鱼卵黄囊消耗殆尽,开始进入外源性营养阶段。仔鱼开口饵料为轮虫(Rotifer),12日龄开始摄食卤虫(Artemia saline)无节幼体。6日龄仔鱼鳔原基形成,16日龄鳔充气成为亮泡状。12日龄仔鱼形成肠道第1个生理弯曲,22日龄仔鱼第2个肠道生理弯曲形成。研究结果可为太平洋鳕亲鱼驯化培育和苗种培育提供基础资料。

关键词：太平洋鳕亲鱼驯化胚胎发育早期发育

太平洋鳕RAG1和IgM基因荧光定量PCR方法的建立及初步应用

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水产学报 2015年第4期39卷 475-484页

作者：李幸温施慧毛明光姜志强蒋洁兰大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室

为研究太平洋鳕发育早期特异免疫系统形成的机制,通过RAG1和Ig M基因的转录水平衡量特异免疫系统的发育特点。根据Gen Bank中RAG1和Ig M的序列信息,分别设计1对特异引物,从太平洋鳕头肾中扩增得到RAG1和Ig M的基因片段。将所获基因片段... 详细信息

为研究太平洋鳕发育早期特异免疫系统形成的机制,通过RAG1和Ig M基因的转录水平衡量特异免疫系统的发育特点。根据Gen Bank中RAG1和Ig M的序列信息,分别设计1对特异引物,从太平洋鳕头肾中扩增得到RAG1和Ig M的基因片段。将所获基因片段分别插入到克隆载体p MD18-T中,从而构建太平洋鳕RAG1和Ig M基因的质粒标准品。建立并优化太平洋鳕RAG1和Ig M基因绝对荧光定量PCR方法。为进一步验证该方法的可靠性,分别利用绝对定量和相对定量检验目的基因在太平洋鳕早期发育过程不同组织内的表达差异。以优化后的绝对荧光定量PCR方法检测不同发育时期太平洋鳕RAG1和Ig M的表达情况。结果显示,RAG1的回归方程为y=-3.266x+33.77,回归系数R2=0.996;Ig M的回归方程为y=-3.119x+27.61,回归系数R2=0.998。绝对定量和相对定量结果在基因转录趋势上显现出一致性,即RAG1基因在胸腺和头肾中表达,且在胸腺中的表达量显著高于头肾中的表达量,在肝脏和脾脏中无表达;Ig M基因在胸腺、头肾、肝脏和脾脏中均有表达,其中脾脏中表达量最高,其次是头肾。RAG1基因在太平洋鳕发育早期的表达水平很低,到61日龄(days posthatching,dph)至95 dph表达量显著提高;Ig M基因在早期表达水平同样很低,到33 dph至61 dph才有明显表达,在95 dph时表达量显著提高。研究表明,本实验方法可靠,特异性较强,可成功对目标基因转录水平进行检测。

关键词：太平洋鳕 RAG1 IgM 绝对荧光定量PCR

太平洋鳕(Gadus macrocephalus Tilesius)仔鱼发育过程

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渔业科学进展 2016年第6期37卷 26-33页

作者：姜云荣于道德刘洪军官曙光张少春张岩农业部海洋渔业可持续发展重点实验室中国水产科学院黄海水产研究所青岛266071 上海海洋大学上海201306 山东省海洋生物研究院青岛266002

采用显微观察、拍照、测量的方法,对太平洋鳕(Gadus macrocephalus Tilesius)人工培育苗种各阶段仔鱼的发育(0–80 dph day post hatching)进行了研究。结果显示,在水温为2–12℃、盐度为28–32、p H为7.8–8.2、光照为800–1200 lx、... 详细信息

采用显微观察、拍照、测量的方法,对太平洋鳕(Gadus macrocephalus Tilesius)人工培育苗种各阶段仔鱼的发育(0–80 dph day post hatching)进行了研究。结果显示,在水温为2–12℃、盐度为28–32、p H为7.8–8.2、光照为800–1200 lx、微充气静水的培育条件下,太平洋鳕早期仔鱼发育主要特征为:0–5 dph仔鱼完全营内源性营养,1 dph仔鱼黑色素沉积较初孵仔鱼颜色加深,眼球出现彩虹色素,5 dph仔鱼消化道已打通(除肝脏外);6 dph仔鱼开口摄食,消化道内有小颗粒物质,营混合性营养;9 dph大部分仔鱼卵黄囊吸收完毕,消化道内充满褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis),进入外源性营养期,血细胞流动清晰可见;12 dph仔鱼头部黄色色素带明显;15 dph仔鱼黑色素和黄色素密集,鳔器官开始形成;17 dph仔鱼开始出现彩虹色素;20 dph仔鱼眼球发育完善,腹动脉可观察到明显的血流,鱼体尾部色素点开始出现;30–50 dph仔鱼各鳍条雏形发育;30 dph仔鱼尾鳍鳍条开始发育;40 dph仔鱼开始摄食卤虫(Artemia sp.),第1、2、3背鳍已出现雏形;50 dph仔鱼尾椎骨开始上翘,臀鳍、背鳍雏形已清晰可见;60–80 dph仔鱼色素细胞进一步发育,各鳍条逐步发育完善,胆囊清晰可见;60 dph仔鱼鳃部呈现红色;70 dph仔鱼腹部有银白色鳞片雏形出现;80 dph仔鱼鳃盖已基本发育完善,腹鳍出现。本研究对太平洋鳕仔稚鱼发育过程进行了描述,可为后续规模化人工繁育的开展提供基础数据。

关键词：太平洋鳕仔鱼发育形态特征

太平洋鳕抗菌肽Hepcidin基因克隆及体外表达研究

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大连海洋大学学报 2020年第1期35卷 83-88页

作者：吴玲梅顾杰温智清贾鹏刘瑞婷蒋洁兰刘荭郑晓聪毛明光大连海洋大学农业农村部北方海水增养殖重点实验室辽宁省北方鱼类应用生物学与增养殖重点实验室辽宁大连116023 深圳海关动植物检验检疫技术中心广东深圳518045 深圳市检验检疫科学研究院广东深圳518045

为揭示太平洋鳕Gadus macrocephalus抗菌肽Hepcidin(GmHep)的分子结构和表达特性,利用qPCR法对平均体质量为2.438 kg鳕不同组织和发育早期的GmHep表达模式进行了探讨,分别构建了原核(pET-32a-GmHep)和真核(pEGFP-GmHep)表达载体,研究了G... 详细信息

为揭示太平洋鳕Gadus macrocephalus抗菌肽Hepcidin(GmHep)的分子结构和表达特性,利用qPCR法对平均体质量为2.438 kg鳕不同组织和发育早期的GmHep表达模式进行了探讨,分别构建了原核(pET-32a-GmHep)和真核(pEGFP-GmHep)表达载体,研究了GmHep的体外表达特点。结果表明:GmHep基因开放阅读框长为297 bp,编码98个氨基酸,蛋白相对分子质量为10833.56,该肽N端具22个氨基酸残基的信号肽,成熟肽含有8个半胱氨酸残基、4个二硫键;氨基酸序列比对发现,GmHep与大西洋鳕Hepcidin同源性最高(93%),但与其他鱼类Hepcidin同源性较低(小于60%),预示其功能具有独特性;GmHep在肝脏中的表达量显著高于其他组织(P太平洋鳕发育早期发挥一定作用。

关键词：太平洋鳕抗菌肽原核表达亚细胞定位

太平洋鳕IRF3基因的克隆及绝对定量表达分析

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中国水产科学 2015年第5期22卷 887-895页

作者：孙航姜志强蒋洁兰温施慧李幸暴宁苏鹏毛明光大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室辽宁大连116023

本研究通过克隆首次得到太平洋鳕(Gadus macrocephalus)干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)的部分序列。该序列长1878 bp,包含长1377 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码459个氨基酸,其编码的蛋白质分子量约为51 k D。经氨基酸序列比对发现,太平洋鳕IRF3的氨基酸序列包括1个含有5个保守色氨酸残基的DNA结合域(DNA binding domain,DBD)和1个保守的C端IRF关联域(IRF association domain,IAD);系统进化树分析表明,太平洋鳕IRF3与其他物种的IRF3亲缘关系较近。应用绝对荧光定量PCR方法对IRF3在不同组织和不同日龄(days post-hatching,dph)仔鱼的表达水平进行检测,并对干扰素在仔鱼期的免疫作用进行分析。组织表达绝对定量结果显示,性腺,肝和胸腺表达量高于其他组织。不同日龄仔鱼IRF3表达量结果显示,IRF3在受精卵就已经表达,在25 dph表达量大幅提高。本研究的结果为进一步研究太平洋鳕干扰素作用机制以及其在早期发育中的作用奠定了基础。

关键词：太平洋鳕 IRF3 干扰素绝对定量PCR

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太平洋鳕染色体核型及银染分析

水生生物学报 2014年第1期38卷 115-120页

作者：范瑞姜志强李雅娟高小强钱聪高敏大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室大连116023

以野生太平洋鳕为材料,采用植物血球凝集素(PHA)及秋水仙素体内注射法,取头肾细胞经低渗、固定后,常规空气干燥法制备染色体标本,并对其染色体核型进行了分析。结果表明,太平洋鳕的二倍体染色体数目为2n=46,核型公式为:2n=8m+6sm+20st+1... 详细信息

以野生太平洋鳕为材料,采用植物血球凝集素(PHA)及秋水仙素体内注射法,取头肾细胞经低渗、固定后,常规空气干燥法制备染色体标本,并对其染色体核型进行了分析。结果表明,太平洋鳕的二倍体染色体数目为2n=46,核型公式为:2n=8m+6sm+20st+12t,NF=60,即有4对中部着丝点染色体、3对亚中部着丝点染色体、10对亚端部着丝点染色体和6对端位着丝点染色体,染色体臂数为NF=60;染色体经银染后,Ag-NORs在不同间期细胞中表现出多态性,数目为1—3,其中2个Ag-NORs的频率最高(82%);在分裂相中,具有1个Ag-NORs的频率最高(87.1%),且在第12对亚端部着丝点染色体的一条带有明显的次缢痕,为Ag-NORs所在区域,并未发现Ag-NORs联合现象及性别相关的异型染色体。

关键词：太平洋鳕染色体核型银染

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太平洋鳕性腺发育及营养来源的初步研究

大连海洋大学学报 2012年第4期27卷 315-320页

作者：姜志强张志明赵翀李丞姜柏桥孙阳大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室辽宁大连116023

通过对大连海域太平洋鳕Gadus macrocephalus的繁殖力、卵径分布、性腺指数(GSI)和肝指数(HSI)进行周年调查,确定出太平洋鳕的繁殖期,分别测定了不同发育期太平洋鳕性腺、肝脏和肌肉的生化组成、能量密度变化,并观察了不同发育期太平洋... 详细信息

通过对大连海域太平洋鳕Gadus macrocephalus的繁殖力、卵径分布、性腺指数(GSI)和肝指数(HSI)进行周年调查,确定出太平洋鳕的繁殖期,分别测定了不同发育期太平洋鳕性腺、肝脏和肌肉的生化组成、能量密度变化,并观察了不同发育期太平洋鳕性腺和肝脏的组织学变化。结果表明:大连海域太平洋鳕的卵巢从12月开始进入第Ⅳ期,至翌年2月份排放;精巢处于Ⅳ、Ⅴ期的时间较长,11月份就有达到成熟的个体;从太平洋鳕肝脏组织学的变化来看,脂滴的体积变化很大,说明在繁殖过程中,肝脏经历了一个脂肪先积累又被大量消耗的过程;太平洋鳕在繁殖过程中,各个组织的能量密度变化较小,但粗蛋白、粗脂肪、粗灰分等成分变化较大。研究表明,太平洋鳕性腺发育的脂肪主要可能来源于肝脏,而肌肉蛋白的下降可能充当了性腺发育中蛋白质的主要来源。

关键词：太平洋鳕性腺肝脏肌肉营养来源

太平洋鳕抗冻基因AFP4的原核表达及多克隆抗体的制备

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大连海洋大学学报 2017年第2期32卷 127-133页

作者：吕绘倩蒋洁兰姜志强毛明光大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室辽宁省北方鱼类应用生物学与增养殖重点实室辽宁大连116023

为进一步研究太平洋鳕Gadus macrocephalus抗冻蛋白AFP4的功能,通过RT-PCR方法克隆得到太平洋鳕4型抗冻蛋白基因(AFP4)的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建原核表达载体并优化表达条件,利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用间... 详细信息

为进一步研究太平洋鳕Gadus macrocephalus抗冻蛋白AFP4的功能,通过RT-PCR方法克隆得到太平洋鳕4型抗冻蛋白基因(AFP4)的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建原核表达载体并优化表达条件,利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的效价,用Western-blot法分析重组蛋白的免疫原性。结果表明:AFP4基因编码区长度为375 bp,编码125个氨基酸;将AFP4基因的ORF与载体p ET-32a连接,构建重组体p ET-32a-AFP4,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中;经诱导、表达和条件优化,发现该重组体在37℃、0.01 mmol/L IPTG条件下诱导3 h获得最大的表达量;对该重组蛋白进行纯化,利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测该抗体效价为1∶1 600 000;Western blot分析显示,重组蛋白可以与兔抗AFP4多克隆抗体发生特异性结合,表明该重组蛋白具有免疫原性。本研究结果可为深入研究太平洋鳕AFP4蛋白功能提供理论依据。

关键词：太平洋鳕抗冻基因原核表达抗体