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捻转血矛线虫天冬氨酸蛋白酶抑制剂的克隆表达及特性分析

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捻转血矛线虫天冬氨酸蛋白酶抑制剂的克隆表达及特性分析

作者：李宝杰南京农业大学

学位级别：硕士

捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是毛圆科(Trichostrongylidae)血矛属(Haemonchus)的胃肠道寄生性线虫。该病原体主要寄生在反刍动物的皱胃中,以吸食宿主胃肠道壁粘膜和血液为生,造成宿主的贫血、腹泻、衰弱甚至死亡。天冬氨酸蛋白... 详细信息

捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是毛圆科(Trichostrongylidae)血矛属(Haemonchus)的胃肠道寄生性线虫。该病原体主要寄生在反刍动物的皱胃中,以吸食宿主胃肠道壁粘膜和血液为生,造成宿主的贫血、腹泻、衰弱甚至死亡。天冬氨酸蛋白酶抑制剂(Aspartyl protease inhibitor,API)指能够特异性地抑制天冬氨酸家族蛋白酶水解活性的一类物质的总称,通过控制水解酶类的活性来参与机体多种生理反应的调控。研究表明寄生虫蛋白酶抑制剂除了有抑制活性之外,在寄生虫的个体发育、宿主入侵、逃避免疫反应和调节免疫应答等方面均有重要作用。对寄生虫蛋白酶抑制剂的研究可以阐明寄生虫的发育和与宿主的相互作用关系,并对研制能够使寄生虫变得对宿主肠道蛋白酶更加易感的药物和疫苗提供思路。本研究首先对捻转血矛线虫天冬氨酸蛋白酶抑制剂进行了克隆表达,而后测定了重组蛋白的抑制活性并分析了其阶段差异性表达情况,对雌虫、雄虫虫体中天然蛋白的组织定位进行分析,研究了该重组蛋白对山羊外周血单个核细胞(PBMC)细胞因子表达情况的变化。***的克隆及原核表达根据捻转血矛线虫天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因序列设计1对特异性引物,通过RT-PCR反应从成虫总RNA中扩增API基因。将此基因片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析;构建原核表达质粒pET32/API并转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导后经SDS-PAGE分析其表达情况,并对重组蛋白进行Western blot分析。结果表明RT-PCR反应扩增出大小约为681 bp的DNA片段,SDS-PAGE电泳结果表明该基因在细菌上清和包涵体中均有表达,相对分子量约为43 × 103,Western blot结果显示人工感染的山羊血清能够识别该重组蛋白。2.重组API的酶抑制活性将重组API蛋白与胃蛋白酶等质量混匀,37 ℃孵育30 min,接着加入底物血红蛋白,继续孵育30 min,通过SDS-PAGE电泳观察底物水解情况的变化来分析重组API抑制胃蛋白酶的水解作用。应用比色法测定重组API对胃蛋白酶的酶活性抑制率及最佳抑制温度。结果表明重组API蛋白能够显著抑制胃蛋白酶的活性,其最高抑制率为63%,最佳抑制pH及温度分别为pH 4.0及37℃～50℃;SDS-PAGE分析结果表明加入重组API可以使底物血红蛋白水解不完全,而重组API对胰蛋白酶的水解能力没有抑制作用。以上结果说明重组API蛋白对天冬氨酸蛋白酶家族的胃蛋白酶具有抑制作用。3.捻转血矛线虫API基因的阶段表达特性分析分别提取捻转血矛线虫虫卵、L3、活化L3、雌虫成虫、雄虫成虫总RNA,然后反转录为cDNA;依据捻转血矛线虫API基因及β-Tubulin基因序列设计荧光定量引物,通过验证引物的扩增效率选择符合要求的引物进行荧光定量PCR反应。以β-Tubulin为内参基因,应用SYBR GREEN染料法进行荧光定量PCR分析API基因在捻转血矛线虫虫卵、L3期幼虫、活化L3期、雌虫成虫、雄虫成虫中的相对表达量。结果显示API基因在雌虫成虫中的表达量最低;在活化L3期幼虫中的表达量约为雌虫的10倍;在L3期的表达量最高,约为雌虫表达量的43倍。***蛋白在捻转血矛线虫雌、雄成虫中的定位制备大鼠抗重组API蛋白抗体,从感染山羊皱胃中挑取捻转血矛线虫成虫制作冰冻切片,用免疫组化技术研究API蛋白在雌虫、雄虫虫体组织中的分布情况。结果发现API在雌虫、雄虫体内均有分布,且主要分布位置集中在皮下组织及肠道中,但在雄虫体内的蛋白丰度较高,雌虫肠道组织中API的表达量较微弱。5.重组API对山羊PBMC表达细胞因子的影响分离山羊PBMCs,以梯度浓度(0,10,20,40 μg/mL)的重组API蛋白刺激,置于37 ℃细胞培养箱中作用24小时。收集经API处理过的PBMCs,提取PBMCs总RNA,反转录成cDNA。以荧光定量PCR的方法对各组中IL-2,IL-4,IL-10,IL-17,TGF-β,IFN-γ等细胞因子的转录水平进行分析。结果表明IFN-γ的转录水平显著上升,IL-4和IL-10的转录水平也有不同程度的上升,其他细胞因子的转录水平变化不明显。

关键词：捻转血矛线虫天冬氨酸蛋白酶抑制剂抑制活性阶段表达免疫组化细胞因子

云芝液体深层发酵天冬氨酸蛋白酶抑制剂的研究

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云芝液体深层发酵天冬氨酸蛋白酶抑制剂的研究

作者：马亚敏江南大学

学位级别：硕士

本论文主要对云芝液体深层发酵天冬氨酸蛋白酶抑制剂的发酵条件、分离纯化及基本特性等进行了研究,主要结果如下: 对甜芝、云芝、韩芝、赤芝G-8等4株菌进行平板培养,比较菌丝体生长速度,其中云芝和赤芝G-8生长最快,速度约为13.7mm/d... 详细信息

本论文主要对云芝液体深层发酵天冬氨酸蛋白酶抑制剂的发酵条件、分离纯化及基本特性等进行了研究,主要结果如下: 对甜芝、云芝、韩芝、赤芝G-8等4株菌进行平板培养,比较菌丝体生长速度,其中云芝和赤芝G-8生长最快,速度约为13.7mm/d,且云芝菌丝体最密,相比之下生长最慢的韩芝只有5.0mm/d。对4株菌进行液体深层发酵,生物量以云芝最高,约为15.06g/L,是韩芝的2.83倍;将发酵液进行真空旋转蒸发浓缩干燥成粉及真空冷冻干燥成粉,然后再进行热水抽提、乙醇沉淀,比较所得物质对胃蛋白酶的抑制效果,仍以云芝发酵组最好,冻干粉抽提液30%-80%醇沉区段的沉淀对胃蛋白酶的抑制率可达29.3%,烘干粉同样处理后也能达到20%左右。比较了云芝发酵液细胞破碎前后对胃蛋白酶的抑制效果,破碎后对胃蛋白酶的抑制率由破碎前的0.53%提高到37.2%,说明云芝胞内确实存对胃蛋白酶起抑制作用的物质。研究了超声波细胞破碎条件对云芝胞内天冬氨酸蛋白酶抑制剂提取的影响,确定最佳超声条件为:超声时间10min、超声功率300W、处理量40mL、超声温度20℃。从细胞破碎液中分离得一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂（CVPI）,建立了云芝胞内天冬氨酸蛋白酶抑制剂的纯化制备工艺为:摇瓶发酵-细胞破碎-大孔树脂D101脱色-DEAE52离子交换层析-ACA54分子筛层析进行CVPI的纯度鉴定及分子量测定。凝胶过滤测定CVPI的相对表观分子量约为23442,主要成分为糖和蛋白质,蛋白比糖约为2.5;CVPI热稳定性较好,100℃保温30分钟后抑制活性几乎没有损失;CVPI的pH稳定范围为3.5～7.5;抑制活性受温度影响不大,0～100℃基本稳定;抑制效果在2小时内随反应时间延长上升较快,2小时后基本不再升高;抑制剂底物特异性研究表明,CVPI对天冬氨酸族的蛋白酶抑制活性较高,以对胃蛋白酶的抑制效果最强;CVPI对胃蛋白酶和蛋白酶A作用时的Ki值分别分别为0.82,1.32μmol/L;CVPI对胃蛋白酶和蛋白酶A的半抑制浓度IC50值分别约为15和29μg/mL;动力学方法研究（Lineweaver-Burk作图法）发现,CVPI是胃蛋白酶的非竞争与反竞争混合型抑制剂,是蛋白酶A的竞争与反竞争混合型抑制剂。利用单因素实验,找到云芝液体深层发酵CVPI的主要影响因子为接种量、起始pH和装液量。在单因素实验的基础上,采用响应面分析法,对培养条件进行了优化,得最佳培养条件:发酵温度为26℃,发酵时间为120小时,转速170r/min,装液量为71.31mL/250mL,起始pH为5.97,接种量为13.96%。优化后的抑制剂产量为10.13IU/mL,比优化前提高了172.3%。

关键词：云芝液体深层发酵天冬氨酸蛋白酶抑制剂基本特性动力学分析半抑制浓度响应面分析

锡兰钩虫天冬氨酸蛋白酶抑制剂的表达与生物学特性研究

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锡兰钩虫天冬氨酸蛋白酶抑制剂的表达与生物学特性研究

作者：刘云秋华南农业大学

学位级别：硕士

锡兰钩虫可感染犬、猫和人,是一种人畜共患的动物源性钩虫。天冬氨酸蛋白酶抑制剂（aspartyl proteinases inhibitors,API）在肠道寄生线虫中普遍存在,具有较强的免疫原性,是潜在的疫苗候选抗原。目前在钩虫中已报道犬钩虫（Ancylostoma... 详细信息

锡兰钩虫可感染犬、猫和人,是一种人畜共患的动物源性钩虫。天冬氨酸蛋白酶抑制剂（aspartyl proteinases inhibitors,API）在肠道寄生线虫中普遍存在,具有较强的免疫原性,是潜在的疫苗候选抗原。目前在钩虫中已报道犬钩虫（Ancylostoma caninum）API（Ac-API-1）的克隆表达和免疫原性,而锡兰钩虫（Ancylostoma ceylanicum）API（Ace-API）的分子特性和生物学功能了解甚少。因此,本论文研究了Ace-API的克隆表达、组织定位、免疫原性及其对蛋白酶活性的影响,为探讨该蛋白作为抗钩虫疫苗的候选分子等生物学功能奠定了基础。1.锡兰钩虫Ace-API基因的扩增、表达与序列分析。根据Gen Bank中Ace-API-1（***705929）序列设计特异性引物,以锡兰钩虫成虫cDNA为模板,采用RT-PCR扩增Ace-API cDNA序列。使用在线软件对其氨基酸序列进行生物信息学和遗传进化分析。利用荧光定量PCR法检测其mRNA在成虫和感染性阶段（L3）的转录情况。结果显示Ace-API cDNA序列长684 bp,编码228个氨基酸。Ace-API氨基酸序列与Ac-API-1和Ad-API-1的同源性分别为96.93%和96.49%,在系统发育树中它们聚为一支。该基因在成虫和L3均有转录,但在成虫的转录水平明显高于L3。***-API的原核表达与组织定位。将Ace-API cDNA序列克隆到原核表达载体pET32a,转化至大肠杆菌BL21（DE3）后用IPTG诱导表达,并用Ni柱亲和层析纯化。分别以Ace-API抗血清（1:2000）,感染犬阳性血清（1:2000）和健康犬血清（1:2000）为一抗,采用Western-blot法检测该重组蛋白的抗原性。利用昆明小鼠制备抗Ace-API多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价;将锡兰钩虫成虫进行固定、石蜡包埋和切片处理,以该多克隆抗体为一抗,山羊抗鼠的FITC-IgG为二抗,与成虫切片进行免疫反应,在荧光显微镜下观察。结果显示该重组蛋白主要以可溶性方式表达,在37℃用1.0 mM IPTG诱导14 h时其表达量最高,纯化后可以获得较纯的目的蛋白。该蛋白能够被抗Ace-API血清和感染犬血清所识别。制备的多克隆抗体效价为1:51200,Ace-API主要定位在成虫分泌腺、假体腔液和皮下组织。***-API的免疫原性和对蛋白酶活性的影响。在健康犬外周血中分离淋巴细胞,将其与不同浓度的重组Ace-API共孵育,采用CCK-8试剂检测其增殖情况。提取该淋巴细胞总RNA,反转录成第一链cDNA,采用荧光定量PCR法检测细胞因子的表达情况。将重组蛋白与胃蛋白酶共孵育,再与其底物血红蛋白反应,并以胰蛋白酶作对照,对所有反应产物进行SDS-PAGE分析。结果显示该重组蛋白在20μg/mL时对淋巴细胞增殖和细胞因子表达具有较强的刺激作用,细胞因子IL-4、IL-10、IL-12、IL-13和IFN-γ的表达水平比对照组明显增加。加入Ace-API后胃蛋白酶对血红蛋白的分解减少,胰蛋白酶对BSA的分解不变,说明该蛋白对胃蛋白酶活性具有抑制作用,对胰蛋白酶无抑制活性。本研究首次从犬源锡兰钩虫成虫中克隆Ace-API基因,并对其进行了原核表达。Ace-API在成虫体内转录水平较高,免疫定位于分泌腺、假体腔液和皮下组织,具有抑制胃蛋白酶的功能,可以刺激外周血淋巴细胞的增殖和细胞因子IL-4、IL-10、IL-12、IL-13和IFN-γ的表达。上述发现表明Ace-API具有研制抗锡兰钩虫疫苗的潜在价值,可为控制钩虫感染提供新的思路。

关键词：锡兰钩虫天冬氨酸蛋白酶抑制剂原核表达组织定位免疫原性酶抑制活性

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两种天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备及特性表征

两种天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备及特性表征

作者：孙莹江南大学

学位级别：硕士

本论文主要研究云芝深层发酵液和马铃薯中两种天冬氨酸蛋白酶抑制剂（CVPI、PPI）的分离纯化过程和两种抑制剂的基本特性表征及作用机理,对云芝深层发酵CVPI的条件进行了优化,并对两种抑制剂的应用潜力进行了初步考察。考察云芝发... 详细信息

本论文主要研究云芝深层发酵液和马铃薯中两种天冬氨酸蛋白酶抑制剂（CVPI、PPI）的分离纯化过程和两种抑制剂的基本特性表征及作用机理,对云芝深层发酵CVPI的条件进行了优化,并对两种抑制剂的应用潜力进行了初步考察。考察云芝发酵产天冬氨酸蛋白酶抑制剂（CVPI）发酵培养基中碳氮源的组成和利用正交试验法确定碳氮源的最佳发酵浓度,确定最佳碳氮源为葡萄糖、马铃薯汁、豆渣粉和蛋白胨,含量分别为1%、1.5%、1%和0.4%,在此培养基基础上进行单因素实验得优化后的培养条件:pH 6.0、装液量70mL/250mL、转速160r/min、接种量10%、温度28℃,优化后CVPI对胃蛋白酶的抑制单位提高到13.1 IU/mL,是优化前的2.01倍。CVPI由云芝深层发酵液经脱色、超滤、DEAE-52、MonoQ离子交换层析等方法得到了纯化,纯化倍数达到21.1倍,比抑制活力达到295.6 IU/mg,经SDS-PAGE鉴定为一种分子量约为22.3 kDa的单亚基蛋白。马铃薯中天冬氨酸蛋白酶抑制剂（PPI）由马铃薯块茎经匀浆、超滤、40-60%乙醇沉淀、DEAE-52、MonoQ离子交换层析得到纯化,纯化倍数为36.6,比抑制活力为149.6 IU/mg,结合SDS-PAGE和UltroGelACA-54分析确定该抑制剂是单亚基,分子量约为16.1 kDa。对PPI基本性质的研究发现,PPI氨基酸组成中酸性氨基酸的含量较高,占32.6%;对胃蛋白酶的最佳抑制反应时间为1h;具有较高的温度稳定性,在20-80%范围内基本保持稳定;在pH稳定范围均为3.0～7.0;属性分析表明PPI本身不是蛋白酶也不能被胃蛋白酶水解;抑制特异性分析表明PPI只对天冬氨酸族的胃蛋白酶具有较高的抑制活性,而对其他家族的蛋白酶基本无抑制活性;动力学分析确定PPI的半抑制浓度IC50为26.67μg/mL,为非竞争性与竞争性混合型抑制剂。将MALDI-TOF MS应用于CVPI及PPI的蛋白质肽谱分析,由数据库搜索结果知,两种抑制剂在氨基酸水平上与其它已知的天冬氨酸蛋白酶抑制剂没有一定的相似性,可能是目前数据库中未报道的抑制剂类型。 CD光谱分析推测CVPI与胃蛋白酶属于相伴型的结合类型,即抑制剂分子与酶分子并列相伴,不占据靶酶结合位点,通过形成氢键的方式封锁酶与底物的结合部位使其失活。而PPI可能是以覆盖型的方式与胃蛋白酶结合,即为阻止底物与酶的活性中心接触以线性分子的形式覆盖到酶活性中心附近的区域上。荧光探针法研究CVPI及PPI与DNA的相互作用,在此基础上依据结果初步判断两者可能具有一定的抗癌效果。抗氧化作用实验表明PPI具有很强的清除羟自由基的作用,具有作为减少自由基对人体伤害的抗氧化剂的潜力。

关键词：云芝马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂分离纯化特性肽谱圆二色谱

十二指肠钩虫天冬氨酸蛋白酶抑制剂的克隆与表达

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中国热带医学 2009年第7期9卷 1181-1183页

作者：张振林邓莉杨陈彭礼飞广东医学院寄生虫学教研室广东湛江524023

目的克隆并表达十二指肠钩虫天冬氨酸蛋白酶抑制剂(Ad-API-1)。方法根据犬钩虫及锡兰钩虫API保守序列设计引物,RT-PCR扩增获得Ad-API-1完整阅读框序列,并将Ad-API-1成熟肽编码序列克隆、连接到原核表达载体pET32a,以构建重组表达质粒,... 详细信息

目的克隆并表达十二指肠钩虫天冬氨酸蛋白酶抑制剂(Ad-API-1)。方法根据犬钩虫及锡兰钩虫API保守序列设计引物,RT-PCR扩增获得Ad-API-1完整阅读框序列,并将Ad-API-1成熟肽编码序列克隆、连接到原核表达载体pET32a,以构建重组表达质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,用Ni亲和层析进行纯化。结果成功克隆获得Ad-API-1完整阅读框序列;构建了pET32a/Ad-API-1重组质粒,Ad-API-1在大肠杆菌中得到了高效表达。结论成功克隆并表达Ad-API-1,为进一步研究Ad-API-1的功能,探讨其作为血清学诊断抗原或保护性疫苗奠定了基础。

关键词：十二指肠钩虫天冬氨酸蛋白酶抑制剂克隆表达

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云芝发酵产胃蛋白酶抑制剂的反应机理探讨

生物技术 2009年第1期19卷 21-24页

作者：刘琦田亚平江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

目的:对一种从云芝发酵液中提取得到的胃蛋白酶抑制剂的动力学性质和反应机理进行研究。方法:采用Lineweaver-Bunk双倒数法和UltroGelACA-54凝胶过滤法。结果:实验证明抑制剂为胞内产物,其成分是蛋白质,分子量为23 100Da,Ki值为0.996μm... 详细信息

目的:对一种从云芝发酵液中提取得到的胃蛋白酶抑制剂的动力学性质和反应机理进行研究。方法:采用Lineweaver-Bunk双倒数法和UltroGelACA-54凝胶过滤法。结果:实验证明抑制剂为胞内产物,其成分是蛋白质,分子量为23 100Da,Ki值为0.996μmol/L。结论:抑制剂对胃酶的抑制类型属于非竞争和反竞争混合型抑制模式,它与胃酶结合作用的方式可能是在酶的活性基团形成氢键并封锁酶与底物的结合部位。

关键词：胃蛋白酶抑制剂天冬氨酸蛋白酶抑制剂云芝动力学反应机理

D-脯氨酸催化的(3S,4S)-4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸衍生物的合成

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合成化学 2016年第4期24卷 355-358页

作者：包可婷张伟李英霞胡春沈阳药科大学制药工程学院辽宁沈阳110016 复旦大学药学院上海201203

报道了一条合成（3S,4S）-4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸（Ahppa）衍生物的新路线。以氨基保护的L-苯丙氨酸为起始原料,依次经Weinreb胺缩合、还原、aldol缩合及溴仿4步反应合成了3个Ahppa衍生物,总收率5.8%-6.7%,其结构经^1H NMR,^13C NMR... 详细信息

报道了一条合成（3S,4S）-4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸（Ahppa）衍生物的新路线。以氨基保护的L-苯丙氨酸为起始原料,依次经Weinreb胺缩合、还原、aldol缩合及溴仿4步反应合成了3个Ahppa衍生物,总收率5.8%-6.7%,其结构经^1H NMR,^13C NMR和ESI-MS确证。对反应条件进行了探讨,结果表明：催化剂D-脯氨酸用量对反应收率影响不大,对立体选择性影响较大;氨基上保护基体积较大有利于提高反应立体选择性。

关键词：苯丙氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂 (3S,4S)-4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸 D-脯氨酸催化药物合成

锡兰钩虫API基因的克隆表达与分子特性研究

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锡兰钩虫API基因的克隆表达与分子特性研究