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映山红花总黄酮促进大鼠脑血管内皮细胞体外形成血管作用及与VEGFR_(2)和神经源性H_(2)S的关系

中国药理学通报 2024年第5期40卷 865-872页

作者：仲美静陈硕陈志武安徽医科大学基础医学院药理教研室安徽合肥230032 安徽中医药大学科研技术中心安徽合肥230038

目的探讨映山红花总黄酮(total flavones of rhododendra,TFR)促大鼠脑血管内皮细胞体外形成血管作用及与VEGFR_(2)和神经源性硫化氢(H_(2)S)的关系。方法采用大鼠脑血管内皮细胞单独培养及和与海马神经元共培养,分别采用不同的实验方... 详细信息

目的探讨映山红花总黄酮(total flavones of rhododendra,TFR)促大鼠脑血管内皮细胞体外形成血管作用及与VEGFR_(2)和神经源性硫化氢(H_(2)S)的关系。方法采用大鼠脑血管内皮细胞单独培养及和与海马神经元共培养,分别采用不同的实验方法检测细胞增殖、迁移、成管及H_(2)S含量和钙离子荧光强度,包括CCK-8法、细胞划痕法、Transwell法、基质胶成管、H_(2)S试剂盒及钙离子荧光探针法。结果在单独培养的大鼠脑血管内皮细胞上,H_(2)S供体NaHS(200μmol·L^(-1))和TFR(90、270、810 mg·L^(-1))对大鼠脑血管内皮细胞的增殖、迁移、成管及[Ca^(2+)]i荧光强度都有明显的促进作用。而VEGFR_(2)阻断剂SU5416(10μmol·L^(-1))可抑制TFR的促进内皮细胞增殖、迁移和形成血管及[Ca^(2+)]i荧光强度;在与海马神经元共培养的大鼠脑血管内皮细胞上,TFR显著地升高共培养中H_(2)S含量,并被CBS抑制剂AOAA(200μmol·L^(-1))抑制。与此同时,TFR明显地促进共培养中大鼠脑血管内皮细胞的形成血管作用,并可被AOAA和VEGFR_(2)阻断剂SU5416显著地抑制。结论TFR在体外可通过VEGFR_(2)升高[Ca^(2+)]i来促进脑血管内皮细胞形成血管,并可通过诱导神经元中CBS生成H_(2)S作用于大鼠脑血管内皮细胞的VEGFR_(2)来促进血管形成。

关键词：硫化氢海马神经元细胞大鼠脑血管内皮细胞增殖迁移成管映山红花总黄酮

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纤维蛋白对大鼠脑血管内皮细胞血管内皮生长因子表达的影响

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国际神经病学神经外科学杂志 2007年第6期34卷 500-503页

作者：薛峥张苏明华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科湖北省武汉市430030

目的观察纤维蛋白对大鼠脑血管内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)转录及蛋白水平表达的影响。方法大鼠脑血管内皮细胞分离后培养,加入不同浓度的纤维蛋白,通过Real-time PCR检测VEGF转录水平,应用酶联免疫方法(ELISA)定量检测培养基和细... 详细信息

目的观察纤维蛋白对大鼠脑血管内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)转录及蛋白水平表达的影响。方法大鼠脑血管内皮细胞分离后培养,加入不同浓度的纤维蛋白,通过Real-time PCR检测VEGF转录水平,应用酶联免疫方法(ELISA)定量检测培养基和细胞裂解液中的VEGF水平。结果纤维蛋白可以特异性诱导大鼠脑血管内皮细胞表达VEGF;加入不同浓度的纤维蛋白(0.03mg/ml、0.1mg/ml、0.3mg/ml和1.0mg/ml),24h后,1.0mg/ml纤维蛋白组的培养基VEGF水平显著增高(P大鼠脑血管内皮细胞分别培养0、2、4、8、24、48h,VEGF浓度在共培养2h已经升高,8h时显著升高,在24h时仍然保持在显著升高表达水平(P大鼠脑血管内皮细胞中VEGF mRNA的上调呈现出剂量和时间依赖性增加。结论纤维蛋白可以上调大鼠血管内皮细胞中的VEGF。

关键词：纤维蛋白大鼠脑血管内皮细胞血管内皮生长因子

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纤维蛋白调节大鼠脑内皮细胞基质金属蛋白酶9的实验研究

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中国现代医学杂志 2008年第21期18卷 3073-3077,3082页

作者：薛峥张苏明华中科技大学附属同济医院神经内科湖北武汉430030

目的观察纤维蛋白与大鼠脑血管内皮细胞共培养对(matrix metalloproteinases9,MMP9)蛋白及转录水平表达的动态变化。方法大鼠脑血管内皮细胞分离后培养,融合良好后,与不同溶度的纤维蛋白共培养,应用酶联免疫方法(ELISA)定量检测MMP9抗... 详细信息

目的观察纤维蛋白与大鼠脑血管内皮细胞共培养对(matrix metalloproteinases9,MMP9)蛋白及转录水平表达的动态变化。方法大鼠脑血管内皮细胞分离后培养,融合良好后,与不同溶度的纤维蛋白共培养,应用酶联免疫方法(ELISA)定量检测MMP9抗原浓度和Real-timePCR半定量检测MMP9 mRNA。结果纤维蛋白可以特异性诱导大鼠脑血管内皮细胞表达MMP9;不同浓度的纤维蛋白与大鼠脑血管内皮细胞共培养24h,1.0mg/mL上清液组的MMP9抗原浓度显著增高(P大鼠脑血管内皮细胞分别培养0、2、4、8、24和48h,MMP9浓度在共培养2h已经升高,8h时显著升高,在24h仍然保持在显著升高表达水平(P大鼠脑血管内皮细胞共培养24h引起MMP9抗原浓度轻度增高,但是在高浓度组明显低于对应浓度的纤维蛋白组引起的MMP9抗原浓度增高(P大鼠脑血管内皮细胞共培养,转录水平检测提示,MMP9 mRNA的上调呈现出剂量和时间依赖性模式。结论纤维蛋白是大鼠脑血管内皮细胞特异性激活剂,可以特异性的上调MMP9表达,在转录水平和蛋白水平均呈现为剂量和时间依赖性模式。

关键词：纤维蛋白大鼠脑血管内皮细胞血管内皮生长因子

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RhoA-PKA通路调控H2S开放大鼠海马神经元BKCa通道和抗神经元H/R损伤及内皮源性H2S对该通道的影响

RhoA-PKA通路调控H2S开放大鼠海马神经元BKCa通道和抗神经元H/R损...

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作者：马紫瑶安徽医科大学

学位级别：硕士

硫化氢(Hydrogen sulfide,HS)作为一种新型气体分子已被证明广泛参与人体各种系统的调节。许多研究表明在血管系统中,HS可以改善血管内皮细胞的功能和舒张血管。它作为一种血管内皮衍生舒张因子,可以由脑血管内皮产生,对缺血性脑损伤有... 详细信息

硫化氢(Hydrogen sulfide,HS)作为一种新型气体分子已被证明广泛参与人体各种系统的调节。许多研究表明在血管系统中,HS可以改善血管内皮细胞的功能和舒张血管。它作为一种血管内皮衍生舒张因子,可以由脑血管内皮产生,对缺血性脑损伤有调节作用。内皮源性HS可由两种途径产生:胱硫醚-γ-裂解酶(Cystathionine-γ-lyase,CSE)和3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-mercaptopyruvate sulfur transferase,3-MST)。前期有相关研究发现HS可以激活平滑肌细胞膜上的钙离子激活钾通道(Ca-sensitive Kchannel,K)和大鼠海马神经细胞大电导钙激活钾(BK)通道,增大相关电流,引起细胞膜超极化,从而舒张血管。Rho A-Rho激酶(Rho-kinase,ROCK)信号通路作为心脑血管系统研究的潜在靶点,可以调节细胞运动、收缩、增殖、血管平滑肌张力及炎症等细胞功能。内皮源性HS可以抑制Rho A-ROCK通路,舒张脑血管,抗缺血性脑损伤。蛋白激酶A(PKA)在细胞中有多种调节作用,已被证明可以抑制Rho A活性,同时可以增大BK通道的活性,但尚未见Rho A是否对PKA有调节作用的研究。因此我们提出这样的科学假设,即HS可能通过抑制Rho A增强PKA的活性,从而开放BK通道。综上本课题通过全细胞膜片钳和其它相关实验技术,拟探讨Rho A-PKA通路在HS开放大鼠海马神经元BK和保护神经元缺氧性损伤中的作用,并采用接近于生理情况的原代大鼠脑血管内皮细胞来探讨内皮源性HS对神经元BK通道。目的:1.探讨Rho A-PKA通路在HS供体Na HS增加大鼠海马神经元BK通道电流中的作用。2.观察大鼠脑血管内皮源性HS对神经元BK通道电流的增加作用。3.探讨Rho A-PKA通路在Na HS保护海马神经元缺氧性损伤中的作用。方法:1.原代培养24 h内SD大鼠乳鼠海马神经细胞和SD成年大鼠脑血管内皮细胞,采用免疫荧光法进行鉴定。2.采用全细胞膜片钳技术,(1)加入BK通道特异性阻断剂伊比利亚毒素(iberiotoxin,IBTX)对大鼠海马神经细胞BK通道的电流进行鉴定;(2)加入Na HS(1×10mol/L)记录外源性HS对大鼠海马神经细胞BK通道电流的影响;(3)加入Rho A抑制剂CCG-1423、Na HS记录Rho A抑制剂预处理对Na HS增加大鼠海马神经元BK通道电流的影响;(4)加入PKA抑制剂H-89、Na HS,记录PKA抑制剂单用及合用Na HS对大鼠海马神经元BK通道电流的影响;(5)加入原代脑血管内皮细胞(ECs)、乙酰胆碱(ACh)和内源性HS合成酶抑制剂DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine,PPG)记录内皮源性HS合成酶CSE抑制剂PPG对大鼠海马神经元BK通道电流的影响;(6)加入ECs、ACh和ASP记录HS合成酶3-MST抑制剂ASP对大鼠海马神经元BK通道电流的影响。3.用Western blot法检测HS对大鼠海马神经细胞Rho A和PKA蛋白表达的影响。4.原代培养大鼠海马神经细胞,建立H/R模型,分为对照组、模型组、Na HS(50、100、200μmol/L)组、CCG-1423(10mol/L)组、CCG-1423+Na HS(200μmol/L)组、H-89(10μmol/L)组、H-89+Na HS(200μmol/L)组一共9组,用CCK-8检测细胞活力,测定乳酸脱氢酶(LDH)和神经特异性烯醇化酶(NSE)活性。5.原代培养大鼠海马神经细胞,建立H/R模型,分为对照组、模型组、Na HS(200μmol/L)组、CCG-1423(10mol/L)组、CCG-1423+Na HS(200μmol/L)组一共5组,Elisa试剂盒检测PKA活性。结果:1.免疫荧光法鉴定两种原代细胞,证明所培养的细胞为大鼠海马神经细胞和大鼠脑血管内皮细胞。2.全细胞膜片钳技术结果表明(1)所得外向电流可被BK通道特异性阻断剂IBTX明显抑制,证明此电流为BK通道电流。(2)加入Na HS(1×10mol/L)能明显增加大鼠海马神经细胞BK通道电流。(3)RhoA抑制剂CCG-1423单用对BK通道电流无明显的影响,其预处理后,Na HS虽仍有一定增加BK通道电流作用,但明显有所减弱。(4)与Control组相比,Na HS(1×10mol/L)明显增大BK通道电流,H-89(10μmol/L)单独使用对60和70m V电压时的BK通道电流有所减小,与Na HS单用时的作用相比,Na HS与H-89合用增大BK通道电流作用有明显的降低;与Na HS组和Control组电流差值比较,H-89+Na HS组与H-89组的电流差值

关键词：硫化氢全细胞膜片钳大鼠海马神经细胞大鼠脑血管内皮细胞大电导钙激活钾通道缺氧复氧损伤 RhoA 蛋白激酶A

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内皮源性CSE产生的H2S介导杜鹃花总黄酮抑制神经细胞中RhoA-ROCK通路保护脑缺血缺氧性损伤的实验研究

内皮源性CSE产生的H2S介导杜鹃花总黄酮抑制神经细胞中RhoA-ROCK...

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作者：盛菊安徽医科大学

学位级别：硕士

大脑是一种对缺氧极其敏感的器官,在缺血的情况下会发生一系列的继发反应,导致脑组织受损及大脑功能的损害,而缺血后的血流再恢复会进一步加重炎症反应从而加剧脑损伤,也被称作脑缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion,I/R）。因此,探... 详细信息

大脑是一种对缺氧极其敏感的器官,在缺血的情况下会发生一系列的继发反应,导致脑组织受损及大脑功能的损害,而缺血后的血流再恢复会进一步加重炎症反应从而加剧脑损伤,也被称作脑缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion,I/R）。因此,探索潜在的脑缺血再灌注损伤治疗药物尤为重要。我们发现从杜鹃花科植物中获取的杜鹃花总黄酮（total flavones of rhododendra,TFR）对脑缺血再灌注损伤有保护作用,其主要成分包括槲皮素、金丝桃苷等黄酮类物质,有一定的药用价值。内源性硫化氢（hydrogen sulfide,HS）是一种细胞内信号分子,能自由的穿过细胞膜,在血管中主要是通过脑血管内皮细胞内的CSE催化L-半胱氨酸形成,具有抗炎、抗氧化应激、促进毛细血管生成和血管舒张的重要功能。Rho A-ROCK信号通路在机体内主要负责细胞的生长、增殖、迁移和分化等重要的信号转导过程,是参与出血性中风脑损伤的重要病理因素。我们以前的研究表明TFR可通过促进HS生成来抑制Rho A-ROCK通路,但其确切机制仍不清楚。因此,本课题使用CSE基因全敲除小鼠（CSE KO）和ROCK基因半敲除小鼠（ROCKHK）,从体内和体外两个方面分别探讨TFR保护脑缺血再灌注损伤作用的促进CSE产生HS抑制ROCK机制。目的:1.探讨血管内皮源性CSE产生的HS对TFR保护小鼠脑缺血再灌注损伤时的作用,以及与Rho A-ROCK通路的关系。2.观察ROCK杂合敲除以及ROCK抑制剂（KD025）对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。3.研究内皮细胞中CSE产生的HS对神经细胞缺氧性损伤的保护作用,以及与Rho A-ROCK通路的关系。方法:1.采用中动脉线栓阻塞方法构建小鼠脑缺血再灌注损伤模型（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）1.1实验分组:野生型CSE小鼠（wide type,WT）和敲除型CSE小鼠（knock out,KO）随机分为9组,每组10只。分别为:Sham WT组、MCAO WT组、TFR40mg/kg WT组、TFR80mg/kg WT组、TFR120mg/kg WT组、Na HS4.8mg/kg WT组,Sham KO组、MCAO KO组、TFR120mg/kg KO组。1.2实验分组:野生型ROCK小鼠（wide type,WT）和杂合敲除型ROCK小鼠（heterozygote knockout,HK）随机分为8组,每组10只。分别为:Sham WT组、Sham+KD025 WT组、MCAO WT组、MCAO+KD025 WT组、TFR120mg/kg WT组,Sham HK组、MCAO HK组、TFR120mg/kg HK组。1.3采用中动脉线栓阻塞方法构建小鼠脑缺血再灌注损伤（Ischemia/Reperfusion,I/R）模型,缺血2小时恢复再灌注24小时。1.4采用激光散斑成像技术（laser speckle imaging,LSI）监测小鼠缺血前,缺血20min后,再灌注20min后脑血流量的变化。1.5根据Zea-Longa的神经功能评分来检测小鼠的神经功能缺陷。1.6采用TTC染色法测定小鼠的脑梗死面积。1.7使用试剂盒检测血清中乳酸脱氢酶（LDH）和神经特异性烯醇化酶（NSE）的水平。1.8使用试剂盒亚甲基蓝法检测脑血管中HS的含量。1.9使用ELISA试剂盒检测Rho A、ROCK和ROCK的活性2.0 Western blot法检测脑海马组织中Rho A、ROCK和ROCK蛋白的表达。2.用SD大鼠在新生后24 h内乳鼠原代培养海马神经元细胞,用SD大鼠原代培养脑血管内皮细胞,待免疫荧光法进行细胞鉴定后,再用Transwell共培养技术,将二种细胞进行共培养。2.1实验分组:NC+EC分为:Control、H/R、H/R+TFR（810 mg/L）、H/R+Na HS（200μmol/L）,NC+EC分为:Control、H/R、H/R+TFR（810 mg/L）、H/R+Na HS（200μmol/L）。2.2除对照组细胞外,其他细胞至三气培养箱（94%N-5%CO-1%O）缺氧10小时后再复氧14小时。2.3使用cck-8试剂盒检测大鼠海马神经细胞活力。2.4采用流式细胞仪和细胞核染色法,测定了大鼠海马神经细胞的凋亡。2.5使用试剂盒测定了大鼠海马神经细胞内乳酸脱氢酶（LDH）和神经特异性烯醇化酶（NSE）的水平。2.6使用试剂盒亚甲基蓝法检测大鼠海马神经元细胞中HS的含量。2.7使用ELISA试剂盒检测大鼠海马神经细胞中Rho A和ROCK的活性。2.8 Western blot法检测大鼠海马神经细胞中Rho A和ROCK蛋白的表达。结果:1.脑

关键词：内源性硫化氢脑缺血再灌注损伤 RhoA-ROCK信号通路大鼠海马神经元细胞大鼠脑血管内皮细胞

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