内皮源性CSE产生的H2S介导杜鹃花总黄酮抑制神经细胞中RhoA-ROCK通路保护脑缺血缺氧性损伤的实验研究

作     者：盛菊 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭岩;陈志武;葛朝亮

授予年度：2023年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：内源性硫化氢 脑缺血再灌注损伤 RhoA-ROCK信号通路 大鼠海马神经元细胞 大鼠脑血管内皮细胞 

摘      要：大脑是一种对缺氧极其敏感的器官,在缺血的情况下会发生一系列的继发反应,导致脑组织受损及大脑功能的损害,而缺血后的血流再恢复会进一步加重炎症反应从而加剧脑损伤,也被称作脑缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion,I/R）。因此,探索潜在的脑缺血再灌注损伤治疗药物尤为重要。我们发现从杜鹃花科植物中获取的杜鹃花总黄酮（total flavones of rhododendra,TFR）对脑缺血再灌注损伤有保护作用,其主要成分包括槲皮素、金丝桃苷等黄酮类物质,有一定的药用价值。内源性硫化氢（hydrogen sulfide,HS）是一种细胞内信号分子,能自由的穿过细胞膜,在血管中主要是通过脑血管内皮细胞内的CSE催化L-半胱氨酸形成,具有抗炎、抗氧化应激、促进毛细血管生成和血管舒张的重要功能。Rho A-ROCK信号通路在机体内主要负责细胞的生长、增殖、迁移和分化等重要的信号转导过程,是参与出血性中风脑损伤的重要病理因素。我们以前的研究表明TFR可通过促进HS生成来抑制Rho A-ROCK通路,但其确切机制仍不清楚。因此,本课题使用CSE基因全敲除小鼠（CSE KO）和ROCK基因半敲除小鼠（ROCKHK）,从体内和体外两个方面分别探讨TFR保护脑缺血再灌注损伤作用的促进CSE产生HS抑制ROCK机制。目的:1.探讨血管内皮源性CSE产生的HS对TFR保护小鼠脑缺血再灌注损伤时的作用,以及与Rho A-ROCK通路的关系。2.观察ROCK杂合敲除以及ROCK抑制剂（KD025）对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。3.研究内皮细胞中CSE产生的HS对神经细胞缺氧性损伤的保护作用,以及与Rho A-ROCK通路的关系。方法:1.采用中动脉线栓阻塞方法构建小鼠脑缺血再灌注损伤模型（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）1.1实验分组:野生型CSE小鼠（wide type,WT）和敲除型CSE小鼠（knock out,KO）随机分为9组,每组10只。分别为:Sham WT组、MCAO WT组、TFR40mg/kg WT组、TFR80mg/kg WT组、TFR120mg/kg WT组、Na HS4.8mg/kg WT组,Sham KO组、MCAO KO组、TFR120mg/kg KO组。1.2实验分组:野生型ROCK小鼠（wide type,WT）和杂合敲除型ROCK小鼠（heterozygote knockout,HK）随机分为8组,每组10只。分别为:Sham WT组、Sham+KD025 WT组、MCAO WT组、MCAO+KD025 WT组、TFR120mg/kg WT组,Sham HK组、MCAO HK组、TFR120mg/kg HK组。1.3采用中动脉线栓阻塞方法构建小鼠脑缺血再灌注损伤（Ischemia/Reperfusion,I/R）模型,缺血2小时恢复再灌注24小时。1.4采用激光散斑成像技术（laser speckle imaging,LSI）监测小鼠缺血前,缺血20min后,再灌注20min后脑血流量的变化。1.5根据Zea-Longa的神经功能评分来检测小鼠的神经功能缺陷。1.6采用TTC染色法测定小鼠的脑梗死面积。1.7使用试剂盒检测血清中乳酸脱氢酶（LDH）和神经特异性烯醇化酶（NSE）的水平。1.8使用试剂盒亚甲基蓝法检测脑血管中HS的含量。1.9使用ELISA试剂盒检测Rho A、ROCK和ROCK的活性2.0 Western blot法检测脑海马组织中Rho A、ROCK和ROCK蛋白的表达。2.用SD大鼠在新生后24 h内乳鼠原代培养海马神经元细胞,用SD大鼠原代培养脑血管内皮细胞,待免疫荧光法进行细胞鉴定后,再用Transwell共培养技术,将二种细胞进行共培养。2.1实验分组:NC+EC分为:Control、H/R、H/R+TFR（810 mg/L）、H/R+Na HS（200μmol/L）,NC+EC分为:Control、H/R、H/R+TFR（810 mg/L）、H/R+Na HS（200μmol/L）。2.2除对照组细胞外,其他细胞至三气培养箱（94%N-5%CO-1%O）缺氧10小时后再复氧14小时。2.3使用cck-8试剂盒检测大鼠海马神经细胞活力。2.4采用流式细胞仪和细胞核染色法,测定了大鼠海马神经细胞的凋亡。2.5使用试剂盒测定了大鼠海马神经细胞内乳酸脱氢酶（LDH）和神经特异性烯醇化酶（NSE）的水平。2.6使用试剂盒亚甲基蓝法检测大鼠海马神经元细胞中HS的含量。2.7使用ELISA试剂盒检测大鼠海马神经细胞中Rho A和ROCK的活性。2.8 Western blot法检测大鼠海马神经细胞中Rho A和ROCK蛋白的表达。结果:1.脑