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酸敏感离子通道1a通过调节AMPK/FoxO3a信号转导通路介导胞外酸化诱导的大鼠关节软骨细胞的自噬

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酸敏感离子通道1a通过调节AMPK/FoxO3a信号转导通路介导胞外酸化...

作者：代贝贝安徽医科大学

学位级别：硕士

目的酸敏感离子通道1a(ASIC1a)是胞外H激活的阳离子通道家族的成员。课题组前期表明ASIC1a参与酸诱导的大鼠关节软骨细胞的自噬。然而,其潜在机制仍不清楚。本研究证实了ASIC1a对大鼠关节软骨细胞的自噬的作用,并探讨了其可能的分子机... 详细信息

目的酸敏感离子通道1a(ASIC1a)是胞外H激活的阳离子通道家族的成员。课题组前期表明ASIC1a参与酸诱导的大鼠关节软骨细胞的自噬。然而,其潜在机制仍不清楚。本研究证实了ASIC1a对大鼠关节软骨细胞的自噬的作用,并探讨了其可能的分子机制。方法1.胞外酸化不同pH(pH 7.0、pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5)处理大鼠关节软骨细胞3小时及在不同时间点(1、3、6、12或24 h)酸化处理软骨细胞(pH 6.0)。然后,利用Western blot法检测Beclin1、LC3B-Ⅱ蛋白表达;qRT-PCR法检测LC3、Beclin1和ATG5 mRNA的表达。结果表明胞外酸化刺激可诱导大鼠关节软骨细胞的自噬。2.胞外酸化(pH 6.0)在不同时间点刺激大鼠关节软骨细胞,利用Western blot检测ASIC1a的表达水平,同时利用免疫荧光法来评估和定位ASIC1a的表达。利用激光共聚焦显微镜检测各种条件下胞内Ca浓度的变化。同时,在应用ASIC1a特异性阻断剂PcTx1和钙离子螯合剂BAPTA-AM之后,检测酸诱导的自噬相关基因和蛋白的表达情况。Monodansylcadaverine(MDC)荧光染色法检测自噬囊泡的形成情况。3.酸处理(pH 6.0)大鼠关节软骨细胞不同时间,Western blot检测FoxO3a蛋白表达。同时,提取核蛋白分析核内FoxO3a的表达,免疫荧光法进一步检测FoxO3a的胞内定位表达。应用ASIC1a特异性阻断剂PcTx1和钙螯合剂BAPTA-AM预处理,Western blot检测酸诱导的FoxO3a蛋白的表达情况。为进一步确定FoxO3a的功能,利用siRNA沉默处理大鼠关节软骨细胞,再利用qRT-PCR和Western blot分析自噬相关基因和蛋白的表达。此外,mcherry-EGFP-LC3B质粒转染,检测沉默FoxO3a之后自噬小体的数目变化情况,后通过透射电镜进一步观察软骨细胞的超微结构变化。4.酸处理(pH 6.0)大鼠关节软骨细胞不同时间,Western blot检测AMPKα的磷酸化水平。预处理ASIC1a特异性阻断剂PcTx1和钙螯合剂BAPTA-AM后,Western blot检测AMPK的磷酸化情况。然后,转染AMPKαsiRNA,利用Western blot分析确定下游FoxO3a的表达水平及自噬相关蛋白的表达。进一步应用AMPK抑制剂,复合物C(Compound C)预处理,qRT-PCR和Western blot法检测FoxO3a和自噬相关基因及蛋白的表达。此外,通过转染EGFP-LC3质粒,观察荧光点聚集情况变化。结果1.胞外酸化诱导了大鼠关节软骨细胞的自噬Western blot结果显示,LC3B-II和Beclin1蛋白在pH 6.0处理3 h后蛋白表达显著增加。qRT-PCR分析也表明,关节软骨细胞LC3,Beclin1和ATG5 mRNA的表达在3 h时最为明显。***1a促进大鼠关节软骨细胞酸诱导的自噬,且与[Ca]增加有关酸处理可增加大鼠关节软骨细胞ASIC1a的蛋白表达。在关节软骨细胞的质膜中观察到ASIC1a的免疫荧光细胞染色,并且其在酸处理的细胞中表达增加。激光共聚焦结果表明酸化刺激(pH 6.0)使胞内的钙离子显著增加。而在应用ASIC1a特异性阻断剂PcTx1和钙螯合剂BAPTA-AM预处理后,可显著降低酸刺激时细胞内钙的浓度。用ASIC1a特异性阻断剂PcTx1和钙螯合剂BAPTA-AM预处理可明显抑制自噬相关蛋白LC3B-II,Beclin1的表达。单丹磺酰尸胺(MDC)染色显示,与对照组相比,酸处理3小时的细胞在细胞质中显示出相当大量的自噬泡,然而,在用抑制剂预处理的关节软骨细胞中自噬泡数目明显减少。以上结果表明,活化的ASIC1a促进大鼠关节软骨细胞的自噬,这与课题组前期的研究相一致。3.转录因子FoxO3a在ASIC1a介导的大鼠关节软骨细胞的自噬中发挥关键作用胞外酸化(pH 6.0)刺激可增加FoxO3a的表达,并且使其核内表达水平增加约两倍,同时免疫荧光结果显示,酸处理可使大鼠关节软骨细胞内FoxO3a表达增加。然而,用ASIC1a特异性阻断剂PcTx1和钙螯合剂BAPTA-AM预处理可减少酸诱导的胞内FoxO3a的蛋白表达。用siRNA沉默FoxO3a可显著降低酸诱导的LC3B-II,Beclin1和ATG5基因和蛋白的表达。在用mCherry-EGFP-LC3B质粒瞬时转染大鼠关节软骨细胞后,与对照相比,酸处理明显提高了自噬溶酶体数目,然而敲除FoxO3a基因减少了酸诱导形成的自噬小体。透射电镜结果亦是如此。这些表明ASIC1a促进了FoxO3a的激活,并且FoxO3a信号的激活在ASIC1a介导的大

关键词：酸酸敏感离子通道1a(ASIC1a) Ca2+ 腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK) 叉头盒蛋白O3a(FoxO3a) 自噬大鼠关节软骨细胞

白术内酯Ⅲ对IL-1β介导大鼠关节软骨细胞损伤的作用研究

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白术内酯Ⅲ对IL-1β介导大鼠关节软骨细胞损伤的作用研究

作者：谭建盛北京中医药大学

学位级别：硕士

目的膝关节骨性关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)作为一种膝关节退行性病变疾病,随着我国步入老龄化社会以及平均寿命的增加,KOA患者数量逐年增加,正成为我国医疗保障的重要挑战。KOA患者主要临床表现为膝关节疼痛和活动受限。早期患者... 详细信息

目的膝关节骨性关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)作为一种膝关节退行性病变疾病,随着我国步入老龄化社会以及平均寿命的增加,KOA患者数量逐年增加,正成为我国医疗保障的重要挑战。KOA患者主要临床表现为膝关节疼痛和活动受限。早期患者往往表现为轻中度的非持续性的疼痛,可因劳累和天气而诱发。随着病情的发展,疼痛逐渐影响患者膝关节屈伸动作,晚期则表现为持续性的剧烈疼痛,甚至影响睡眠,此时关节外观形变,可致畸致残。KOA的主要病理性改变是软骨细胞的凋亡、膝软骨基质的破坏,以及在此基础上长期磨损导致的软骨下骨和关节周边滑膜的炎症反应。随着研究的深入,表明KOA的发生发展可能与MMPs/TIMPs系统的平衡被打破有关。在炎症因子IL-1β介导下发生了一系列炎症反应的发生,导致MMPs成员表达水平增加,TIMPs表达水平下降,表现为软骨组织的逐步降解,同时软骨细胞出现凋亡。KOA患者临床上常常表现为关节浮肿,肢体倦怠,下肢乏力等症状,可归为中医“脾虚证”范畴,通过重用白术的自拟方治疗KOA患者,获得不错的治疗效果。但白术成分对软骨细胞毒性试验及是否可以改善IL-1β介导的炎症反应,是否可以降低降解软骨细胞外基质的水解酶的表达值得进一步探讨。因此本课题通过不同浓度白术内酯Ⅲ干预大鼠关节软骨细胞,测定白术内酯Ⅲ对软骨细胞的细胞毒性。通过观察白术内酯Ⅲ对IL-1β介导的大鼠关节软骨细胞凋亡的影响:分别测定各组MMP-1、MMP-13、TIMP-1、Bax、Bcl-2表达含量,分析白术内酯Ⅲ的作用靶点。为中医药治疗KOA提供可能的分子生物学理论依据并为后续白术单体成分在KOA深入研究提供实验基础。方法1.采用CCK-8法检测IL-1β诱导大鼠膝软骨细胞损伤时细胞活力的改变,根据细胞形态改变及细胞OD值的改变,确定IL-1β诱导大鼠膝软骨细胞损伤拟KOA体外模型的最佳造模浓度。2.将IL-1β作用于稳定传代的大鼠膝软细胞24 h,建立模拟KOA体外模型后,使用CCK-8实验方法观察不同浓度白术内酯Ⅲ对模型的疗效,并观察白术内酯Ⅲ对正常大鼠膝软骨细胞的影响,筛选白术内酯Ⅲ最佳药物浓度。3.利用Hoechst33342凋亡染色及Western blot的实验方法研究白术内酯Ⅲ对IL-1β介导大鼠膝软骨细胞中Bax、Bcl-2、MMP-1、MMP-13、TIMP-1的蛋白表达量的影响。结果1.与空白对照组相比,IL-1β浓度为10、20ng/ml,孵育细胞24及48h时,其OD值无明显变化(P>0.05),当40、80 ng/ml孵育细胞24及48h时,细胞OD值较空白对照组显著降低,差异具有统计学意义(P大鼠膝软骨细胞没有毒性,将浓度1.25、2.5、5 μg/ml分别设为低浓度组、中浓度组、高浓度组。*** 33342染色结果显示模型组荧光强度高于空白对照组(P0.05),中、高浓度组荧光强度低于模型组(P0.05)。结论白术内酯Ⅲ可减轻IL-1β介导大鼠膝软骨细胞损伤,其机制可能是通过调节MMPs/TIMP-1之间的平衡,并降低Bax,同时增加Bcl-2蛋白的表达进而改善软骨细胞的凋亡而发挥其对软骨细胞的保护作用。

关键词：白术内酯Ⅲ 大鼠关节软骨细胞凋亡基质金属蛋白酶 IL-1β 膝关节骨性关节炎

自噬对酸敏感离子通道1a介导的大鼠关节软骨细胞凋亡的影响

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自噬对酸敏感离子通道1a介导的大鼠关节软骨细胞凋亡的影响

作者：谢亚亚安徽医科大学

学位级别：硕士

目的类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种由多种原因引起的退行性关节疾病,但具体的发病机制尚不清楚。本课题组前期实验证实,酸敏感离子通道1a(acid-sensing ion channel 1a,ASIC1a)被胞外酸通过介导胞外Ca2+内流活化,且ASI... 详细信息

目的类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种由多种原因引起的退行性关节疾病,但具体的发病机制尚不清楚。本课题组前期实验证实,酸敏感离子通道1a(acid-sensing ion channel 1a,ASIC1a)被胞外酸通过介导胞外Ca2+内流活化,且ASIC1a介导的关节软骨细胞凋亡在RA进展过程中发挥重要的作用。本研究主要目的是在体外探究自噬对ASIC1a介导的大鼠关节软骨细胞凋亡的影响,探讨自噬在RA发病进程中的作用。方法体外分离、提取及培养原代大鼠关节软骨细胞,给于适宜浓度的浓盐酸刺激,体外建立早期RA模型。在此基础上,采用ASIC1a特异性阻断剂狼蛛毒素(psalmotoxin 1,Pc TX1)及ASIC1a短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)阻断或沉默ASIC1a,实验分为正常组、p H6.0组、Pc TX1组、p H6.0+Pc TX1组和正常组、p H6.0组、ASIC1a sh RNA组、p H6.0+ASIC1a sh RNA组,分别观察ASIC1a对自噬和凋亡的影响。采用自噬特异性阻断剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)及Beclin1小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)阻断或沉默自噬,实验分为正常组、p H6.0组、,3-MA组、p H6.0+3-MA组和正常组、p H6.0组、Beclin1 si RNA组、p H6.0+Beclin1 si RNA组,观察自噬对ASIC1a介导的酸诱导的大鼠关节软骨细胞凋亡的影响。透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)观察细胞内自噬小体;单丹黄酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色观察自噬囊泡的形成;GFP-m RFP-LC3观察自噬成熟过程;Western blot技术分析自噬相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达情况;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果胞外酸化可明显上调自噬蛋白LC3-II水平,显著增加胞质内自噬小体数量;胞外酸化(p H6.0)3h自噬蛋白LC3-II、Beclin1,凋亡相关蛋白剪切性PARP、剪切性Caspase-3及剪切性Caspase-9均高表达,该过程可被Pc TX1及ASIC1a sh RNA逆转;3-MA降低ASIC1a介导的细胞自噬,并增加ASIC1a介导的细胞凋亡,表现为LC3-II、Beclin1蛋白的下调,剪切性PARP、剪切性Caspase-3及剪切性Caspase-9蛋白的上调以及细胞凋亡率的增加;此外,预处理的Beclin1 si RNA降低了自噬蛋白LC3-II、Beclin1的表达,增加了凋亡蛋白剪切性PARP、剪切性Caspase-3及剪切性Caspase-9的表达以及上调了细胞凋亡率。结论结果显示激活的ASIC1a可在体外介导大鼠关节软骨细胞凋亡和自噬的发生,阻断或沉默自噬可以增强ASIC1a介导的细胞凋亡,因此在RA发病过程中自噬可能被作为一种新的机制参与了ASIC1a介导的关节软骨细胞凋亡。自噬的检测有助于进一步揭示早期关节损伤和RA的发病机制。

关键词：酸敏感离子通道1a 类风湿性关节炎大鼠关节软骨细胞凋亡自噬

酸敏感离子通道1a通过调节钙蛋白酶-2/钙调神经磷酸酶通路来介导酸化诱导的大鼠关节软骨细胞的焦亡

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酸敏感离子通道1a通过调节钙蛋白酶-2/钙调神经磷酸酶通路来介导...

作者：祖胜芹安徽医科大学

学位级别：硕士

类风湿性关节炎(RA)是一种伴随着关节软骨退化的慢性系统性自身免疫性疾病,细胞焦亡作为其发生的一个原因而备受关注。前期研究结果表明在大鼠关节软骨细胞中胞外酸化能通过激活NLRP3炎症小体来介导软骨细胞发生焦亡。然而,胞外酸化诱... 详细信息

类风湿性关节炎(RA)是一种伴随着关节软骨退化的慢性系统性自身免疫性疾病,细胞焦亡作为其发生的一个原因而备受关注。前期研究结果表明在大鼠关节软骨细胞中胞外酸化能通过激活NLRP3炎症小体来介导软骨细胞发生焦亡。然而,胞外酸化诱导大鼠关节软骨细胞发生焦亡的具体机制目前尚不清楚。酸敏感离子通道属于一类阳离子通道,由胞外酸化所激活的。大量文献研究表明:在关节炎中,胞外酸化能够通过激活ASICs上调calpain和calcineurin的表达。研究表明:calpain、calcineurin与细胞焦亡密切相关,而软骨细胞胞外酸化过程中是否存在着ASIC1a介导的细胞焦亡,以及ASIC1a是否是通过调节calpain-2、calcineurin蛋白的表达来参与细胞焦亡目前尚不清楚。本课题通过体外实验研究胞外酸化是否是通过激活ASIC1a来介导大鼠关节软骨细胞发生焦亡,同时观察calpain-2/calcineurin通路在此过程中发挥的作用。本课题的研究内容主要分为以下四个方面:1.体外实验研究胞外酸化对ASIC1a,calpain,calcineurin和NLRP3炎症小体的影响。关节软骨细胞分组如下:(1)分别用含1%FBS的pH7.4、pH7.0、pH6.5和pH6.0的培养基培养各组细胞6h。(2)pH7.4正常组、pH6.0胞外酸化1h组、胞外酸化3h组、胞外酸化6h组、胞外酸化12h组和胞外酸化24h组,酸化刺激相应的时间后来收集细胞。结果表明:用不同pH酸化刺激软骨细胞6h,pH6.0条件下ASIC1a蛋白表达增加得最为显著。用pH6.0酸化刺激软骨细胞6h时ASIC1a蛋白表达达到最大值。qpcr结果显示:用pH6.0酸化刺激软骨细胞12h时calpain-1、calpain-2、calcineurin mRNA表达增加得最为显著。Western blot结果显示:用pH6.0酸化刺激软骨细胞12h时calpain-1、calpain-2、calcineurin蛋白表达与mRNA表达结果一致。qpcr结果显示:用pH6.0酸化刺激软骨细胞24h时NLRP3、ASC、caspase-1mRNA表达增加得最为显著。Western blot结果显示:用pH6.0酸化刺激软骨细胞24h时NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达与mRNA表达结果一致。以上结果表明:胞外酸化刺激可以显著上调ASIC1a、calpain、calcineurin和NLRP3炎症小体的表达。2.体外实验研究关节软骨细胞中沉默和阻断ASIC1a对胞外酸化刺激的calpain-2、calcineurin和细胞焦亡的影响。关节软骨细胞分组如下:pH7.4正常组、pH6.0酸化组、pH6.0+空质粒对照组、pH6.0+ASIC1a沉默组和pH6.0+Pctx-1(100ng/ml)组(ASIC1a特异性的抑制剂),细胞经过相应处理后再使用pH6.0的培养基酸化处理6h。实验结果表明ASIC1a shRNA处理关节软骨细胞6h时,细胞内ASIC1a、calpain-2、calcineurin、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的表达明显受到抑制。AO/EB结果显示,pH7.4的正常组细胞死亡数较少,pH6.0酸化组软骨细胞被染成橘黄色,着色细胞比例增加,细胞死亡明显增多,用ASIC1a shRNA处理可以明显抑制软骨细胞死亡。LDH结果显示,pH7.4的正常组细胞释放的LDH较少,pH6.0酸化组LDH释放显著增加,control shRNA组LDH释放与pH6.0酸化组无差异,用ASIC1a shRNA和PcTX1处理可以明显抑制LDH的释放。ELISA结果显示,pH7.4的正常组细胞分泌的IL-1β较少,pH6.0酸化组IL-1β分泌显著增加,control shRNA组IL-1β分泌与pH6.0酸化组无差异,用ASIC1a shRNA和Pc TX1处理可以明显抑制IL-1β的分泌。以上结果表明:阻断ASIC1a能够抑制胞外酸化刺激的calpain-2,calcineurin蛋白表达的升高以及酸化刺激诱导的关节软骨细胞的焦亡。3.体外实验研究关节软骨细胞中沉默和阻断calpain-2对胞外酸化刺激的calcineurin和细胞焦亡的影响。关节软骨细胞分组如下:pH7.4正常组、pH6.0酸化组、pH6.0+空质粒对照组、pH6.0+calpain-2沉默组和pH6.0+calpain-2抑制剂calpeptin组,细胞经过相应处理后再使用pH6.0的细胞培养基酸化处理12h。实验结果表明calpain-2 shRNA处理关节软骨细胞12h时,细胞内calpain-2、calcineurin、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的表达明显受到

关键词：酸化酸敏感离子通道钙蛋白酶-2 钙调神经磷酸酶炎症小体细胞焦亡大鼠关节软骨细胞

m6a甲基化修饰调控miRNA-145成熟对炎症环境关节软骨损伤修复的作用

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m6a甲基化修饰调控miRNA-145成熟对炎症环境关节软骨损伤修复的作...

作者：卞继超济宁医学院

学位级别：硕士

目的:骨关节炎(Osteoarthritis,OA)的病理特征主要表现为关节软骨损伤,因此,保护软骨功能、遏止软骨破坏,是诊治骨性关节炎的研究重点。然而,m6a甲基化酶METTL3调控miRNA-145成熟在大鼠软骨组织和软骨细胞中的作用尚不清楚。通过对该机... 详细信息

目的:骨关节炎(Osteoarthritis,OA)的病理特征主要表现为关节软骨损伤,因此,保护软骨功能、遏止软骨破坏,是诊治骨性关节炎的研究重点。然而,m6a甲基化酶METTL3调控miRNA-145成熟在大鼠软骨组织和软骨细胞中的作用尚不清楚。通过对该机制的探讨,或许可为临床治疗OA提供一种新的思路和方法。方法:首先,在体外实验我们构建了 METTL3干扰和过表达载体,将它们分别转入IL-1β诱导损伤的大鼠软骨细胞中。采用CCK-8检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,qPCR检测NF-κB信号通路、OPG、MMP13的表达。同时,qPCR检测miRNA-145及其前体的表达情况,Elisa检测炎症因子IL-6、IL-8、IL-10的表达情况。机制研究中,MeRIP-qPCR实验分析过表达DGCR8或METTL3可增加细胞中pri-miR-145 m6a甲基化位点的m6a修饰水平,Co-IP实验分析METTL3与DGCR8和m6a蛋白相互作用情况。其次,在体内研究中,我们构建了 SD大鼠OA模型,将大鼠随机分成正常组,模型组,METTL3干预组。在建模型的第四周后,取下SD大鼠的膝关节组织,对大鼠膝关节软骨进行大体观察。利用HE染色和甲苯胺蓝染色法分析关节软骨的病理学组织结构变化。qPCR检测miRNA-145及其前体的表达情况。结果:体外实验结果证实了在IL-1β诱导损伤的大鼠软骨细胞中,下调METTL3可抑制细胞凋亡,促进细胞增殖,导致IL-6、IL-8蛋白浓度的降低和IL-10蛋白浓度的增加,miRNA-145表达下降,其前体pri-miRNA-145表达增加;此外,下调METTL3导致了 OPG mRNA表达水平的上升,MMP-13、p65、IKBα表达下降。机制研究结果:RIP实验显示DGCR8与pri-miR-145-5p之间存在互作关系,Co-IP实验证实METTL3分别与DGCR8和m6a存在互作关系。体内实验:与模型组比较,METTL3过表达后大鼠软骨组织结构层次更加模糊,软骨层更薄,软骨细胞数目更少,炎症细胞浸润程度更加严重。同时,METTL3上调使pri-miR-145-5p表达进一步下调,miR-145-5p表达上调。体内外实验结果保持一致。结论:m6a甲基化酶METTL3修饰调控miRNA-145成熟并在炎症环境关节软骨损伤修复中发挥作用。METTL3作为OA严重程度的重要指标,下调METTL3可抑制软骨细胞凋亡和促进软骨细胞增殖,从而逆转关节软骨损伤。通过对该机制研究,可为临床上骨性关节炎的治疗提供新的方向和作用靶点。

关键词：骨关节炎 m6a METTL3 miR-145 大鼠关节软骨细胞

酸敏感离子通道1a介导的NLPR3炎症小体的激活在佐剂性大鼠关节软骨中的作用及可能机制

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酸敏感离子通道1a介导的NLPR3炎症小体的激活在佐剂性大鼠关节软...

作者：朱传君安徽医科大学

学位级别：硕士

目的类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性自身免疫性疾病,软骨的破坏是RA患者致残的根本原因之一。酸敏感离子通道1a(ASIC1a)是一类可由胞外酸化所激活的阳离子通道,广泛存在于细胞膜上。课题组前期研究结果表明,在AA大... 详细信息

目的类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性自身免疫性疾病,软骨的破坏是RA患者致残的根本原因之一。酸敏感离子通道1a(ASIC1a)是一类可由胞外酸化所激活的阳离子通道,广泛存在于细胞膜上。课题组前期研究结果表明,在AA大鼠关节软骨中,存在ASIC1a的表达,且可以促进大鼠关节软骨NLRP3炎症小体的表达。然而,其潜在机制尚不清楚。本研究进一步证实了ASIC1a对大鼠关节软骨中NLRP3炎症小体表达的作用,并探讨了其可能的分子机制以及NLRP3炎症小体的激活对关节软骨的影响。方法1.在体内使用CFA试剂构建AA大鼠模型,观察造模不同时期,NLRP3炎症小体表达的动态变化。分别在造模第0、7、14、21、28、35天时将大鼠处死,利用苏木精、伊红(HE)染色法观察大鼠踝关节病理变化,免疫组化和Western blot检测关节软骨组织NLRP3炎症小体相关蛋白nod-likereceptorprotein3(NLRP3),apoptosis-associatedspeck-likeprotein(ASC),caspase-1的表达变化。2.在体外观察,酸化处理对大鼠关节软骨细胞NLRP3炎症小体表达的影响。原代大鼠关节软骨细胞在不同酸性浓度(pH 7.4、pH 7.0、pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5)条件下处理24小时及在pH 6.0条件下酸化不同时间(0、3、6、12、24 h)。然后利用Western blot法检测蛋白ASIC1a、NLRP3、ASC、caspase-1的表达;qRT-PCR法检测NLRP3,ASC,caspase-1 mRNA的表达。3.在体外观察,阻断和沉默ASIC1a对大鼠关节软骨细胞NLRP3炎症小体表达的影响。原代大鼠关节软骨细胞分为:pH 7.4正常组、pH 6.0酸化组、pH 6.0+NC组、pH 6.0+ASIC1a shRNA组以及pH 6.0+ASIC1a特异性抑制剂PcTx-1(100ng/ml)组。利用Western blot检测ASIC1a,NLRP3,ASC,caspase-1,NF-κB p65,NF-κB pp65的表达水平。结果表明阻断和沉默ASIC1a,能够明显降低NLRP3炎症小体及NF-κB的表达。4.在体外观察,NF-κB信号通路在ASIC1a介导的NLRP3炎症小体表达中的作用。原代大鼠关节软骨细胞分为以下三组:pH 7.4正常组、pH 6.0酸化组以及pH6.0+NF-κB特异性抑制剂BAY 11-7082(10uMl)组。利用Western blot和细胞免疫荧光方法检测NF-κB表达情况,利用Western blot,qRT-PCR以及ELISA方法检测NLRP3,ASC,caspase-1以及IL-1β的表达情况。5.在体外观察,NLRP3炎症小体的激活在大鼠关节软骨中的作用。原代大鼠关节软骨细胞分为以下三组:pH 7.4正常组、pH 6.0酸化组以及pH 6.0+caspae-1特异性抑制剂AC-YVAD-CHO(10uMl)组。利用Western blot,qRT-PCR以及caspase-1检测试剂盒检测caspase-1表达情况,利用AO-EB染色,LDH以及MTT方法检测大鼠关节软骨细胞活性,利用Western blot方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3以及cleaved-caspase-3的表达情况,流式细胞术检测凋亡率,利用qRT-PCR和ELISA方法检测IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。结果1.体内实验结果表明,在AA大鼠关节软骨中存在NLRP3炎症小体的表达。HE染色结果表明:与正常组相比,造模组大鼠关节出现明显损害,具体表现为造模组大鼠关节面凹凸不平,存在明显的滑膜组织异常增生及炎性细胞浸润。这种破坏情况从造模的第1天到28天呈现递增趋势,35天时有所改善。免疫组化和Western blot结果显示,与正常大鼠相比,造模组大鼠关节软骨中NLRP3,ASC和caspase-1蛋白表达显著增加,且呈现时间依赖性,在第28或35天时表达最为明显。体外实验表明,胞外酸化能上调大鼠关节软骨细胞NLRP3炎症小体的表达水平,且pH 6.0处理24h后mRNA和蛋白表达水平显著增加。***1a促进胞外酸化诱导的大鼠关节软骨细胞NLRP3炎症小体的表达。由Western blot结果可看出,酸性条件刺激下(pH 6.0),ASIC1a以及NLRP3相关蛋白表达量明显增加。沉默和阻断ASIC1a,能够明显降低酸诱导的NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3,ASC,caspase-1)水平。结果表明,ASIC1a可参与大鼠关节软骨细胞中NLRP3炎症小体的表达。***-κB

关键词：酸酸敏感离子通道1a(ASIC1a) NLRP3炎症小体 caspase-1 NF-κB 大鼠关节软骨细胞类风湿性关节炎

酸敏感离子通道1a介导的程序性坏死在佐剂性关节炎大鼠关节软骨损伤中的作用及其机制

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酸敏感离子通道1a介导的程序性坏死在佐剂性关节炎大鼠关节软骨损...

作者：陈勇安徽医科大学

学位级别：硕士

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种由自身免疫引起的多发性关节炎,以慢性、炎症性和全身性疾病为特征,可导致滑膜炎、关节软骨和骨质侵蚀,最终演变成关节畸形。受影响关节的软骨损伤可能是RA致病原因之一。程序性坏死(Necrop... 详细信息

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种由自身免疫引起的多发性关节炎,以慢性、炎症性和全身性疾病为特征,可导致滑膜炎、关节软骨和骨质侵蚀,最终演变成关节畸形。受影响关节的软骨损伤可能是RA致病原因之一。程序性坏死(Necroptosis)是由受体相互作用蛋白1(Receptor interacting protein1,RIP1)和受体相互作用蛋白3(RIP3)调节的一种可控的细胞死亡途径,在多种疾病的生理和病理过程中发挥着重要的平衡调节作用,包括退行性、炎症性和传染性疾病;然而,到目前为止程序性坏死在RA病理性软骨破坏方面仍没有相关研究报道。酸敏感离子通道(Acid-sensing ion channels,ASICs)属上皮细胞钠通道/退化蛋白超家族的一员,ASICs离子通道活性可由细胞外H瞬时激活。本课题组前期工作表明酸敏感离子通道1a(Acid-sensing ion channel 1a,ASIC1a)在大鼠关节软骨细胞中表达并在佐剂型关节炎(Adjuvant arthritis,AA)大鼠关节软骨中表达显著增加,且阿米洛利阻断ASICs可以缓解大鼠关节软骨损伤,提示ASIC1a在大鼠关节软骨破坏中可能作为新的靶点发挥调控作用。同时,最近研究表明了ASIC1a介导的RIP1激活可以导致缺血性神经元损伤,ASIC1a基因的敲除可显著阻止RIP1磷酸化并缓解脑损伤。然而,其确切的分子机制仍不清楚。因此,我们在体内和体外实验探究了RIP1/RIP3/p-MLKL程序性坏死通路的激活与ASIC1a介导的AA大鼠关节软骨损伤之间的联系。本课题主要开展了以下相关实验:1.观察程序性坏死在不同时期AA大鼠关节软骨组织中动态变化过程及对关节软骨损伤的影响140-160 g雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为以下几组:非关节炎组(n=8)和AA组(n=40)。然后,将AA组中的大鼠分别分成5个亚组分:7天,14天,21天,28天,35天(n=8)。实验中称量大鼠体重,收集大鼠的下腔动脉血用于ELISA检测,踝关节和膝关节用于病理观察和相关指标检测。实验结果显示,弗氏完全佐剂(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)成功诱导AA大鼠模型,与正常大鼠相比AA大鼠后爪出现明显的红色肿胀伴有体重增长减缓。苏木精和伊红(Hematoxylin and eosin,H&E)的染色结果显示正常大鼠关节完整,软骨平滑无损伤,AA大鼠滑膜组织异常增生,关节软骨及下骨侵蚀,炎性细胞浸润滑膜并侵入阻塞关节腔。免疫组织化学染色结果显示关节软骨II型胶原的表达随时间依赖性降低。此外,AA大鼠血清TNF-α和IL-1β水平显著升高。蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测AA大鼠关节软骨组织中的RIP1,RIP3,p-MLKL和PGAM5蛋白表达水平急剧增加,RIP1和RIP3免疫组化染色结果与WB结果相比一致,表明RIP1/RIP3/p-MLKL途径被激活。此外,WB检测显示AA大鼠关节软骨组织TNF-α,IL-1β和IL-6蛋白表达增加,与程序性坏死相关蛋白结果相一致,提示程序性坏死可能参与了AA大鼠关节软骨损伤。***1a介导的程序性坏死对AA大鼠关节软骨损伤的影响免疫荧光双标记检测ASIC1a和RIP1在关节软骨组织中的共表达情况。在抑制剂给药组实验中,大鼠随机分为非关节炎组(n=8)和AA组(n=24)。后者分为以下组:未处理的AA组;阿米洛利给药组;Nec-1给药组(每组n=8)。免疫荧光双标记结果显示ASIC1a和RIP1在AA大鼠关节软骨组织中有高度共定位现象且共表达明显高于正常组,ASICs非特异性抑制剂阿米洛利或RIP1特异性抑制剂Nec-1给药后的AA组大鼠的体重增长和关节软骨II型胶原蛋白表达增加,足爪肿胀度和血清TNF-α、IL-1β水平降低。H&E结果表明阿米洛利或Nec-1给药后关节软骨病理破坏明显减轻;TEM结果显示在CFA注射5周后软骨细胞明显肿胀,膜裂解和细胞器消失。Nec-1或阿米洛利组关节软骨细胞仅略微肿胀,细胞完整性保存较好,细胞的坏死程度明显减轻。机制实验证明Nec-1或阿米洛利降低了程序性坏死蛋白RIP1,RIP3,p-MLKL,PGAM5和促炎细胞因子蛋白TNF-α,IL-1β和IL-6的表达。结果提示阻断ASIC1a可以抑制关节软骨程序性坏死从而缓解AA大鼠关节软骨损伤。3.胞外酸化处理对原代大鼠关节软骨细胞程序性坏死的影响体外实验细胞分组为:大鼠关节软骨细胞不同pH浓度胞外酸化2 h组(pH7.4、pH 7.0、pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5、pH 5.0)及在pH 6.0酸化不同时间点组(0、1、2、3、4或5h)和(

关键词：酸中毒酸敏感离子通道1a(ASIC1a) 类风湿性关节炎程序性坏死佐剂性关节炎(AA) 大鼠关节软骨细胞