酸敏感离子通道1a通过调节AMPK/FoxO3a信号转导通路介导胞外酸化诱导的大鼠关节软骨细胞的自噬

作     者：代贝贝 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈飞虎

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：酸 酸敏感离子通道1a(ASIC1a) Ca2+ 腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK) 叉头盒蛋白O3a(FoxO3a) 自噬 大鼠关节软骨细胞 

摘      要：目的酸敏感离子通道1a(ASIC1a)是胞外H激活的阳离子通道家族的成员。课题组前期表明ASIC1a参与酸诱导的大鼠关节软骨细胞的自噬。然而,其潜在机制仍不清楚。本研究证实了ASIC1a对大鼠关节软骨细胞的自噬的作用,并探讨了其可能的分子机制。方法1.胞外酸化不同pH(pH 7.0、pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5)处理大鼠关节软骨细胞3小时及在不同时间点(1、3、6、12或24 h)酸化处理软骨细胞(pH 6.0)。然后,利用Western blot法检测Beclin1、LC3B-Ⅱ蛋白表达;qRT-PCR法检测LC3、Beclin1和ATG5 mRNA的表达。结果表明胞外酸化刺激可诱导大鼠关节软骨细胞的自噬。2.胞外酸化(pH 6.0)在不同时间点刺激大鼠关节软骨细胞,利用Western blot检测ASIC1a的表达水平,同时利用免疫荧光法来评估和定位ASIC1a的表达。利用激光共聚焦显微镜检测各种条件下胞内Ca浓度的变化。同时,在应用ASIC1a特异性阻断剂PcTx1和钙离子螯合剂BAPTA-AM之后,检测酸诱导的自噬相关基因和蛋白的表达情况。Monodansylcadaverine(MDC)荧光染色法检测自噬囊泡的形成情况。3.酸处理(pH 6.0)大鼠关节软骨细胞不同时间,Western blot检测FoxO3a蛋白表达。同时,提取核蛋白分析核内FoxO3a的表达,免疫荧光法进一步检测FoxO3a的胞内定位表达。应用ASIC1a特异性阻断剂PcTx1和钙螯合剂BAPTA-AM预处理,Western blot检测酸诱导的FoxO3a蛋白的表达情况。为进一步确定FoxO3a的功能,利用siRNA沉默处理大鼠关节软骨细胞,再利用qRT-PCR和Western blot分析自噬相关基因和蛋白的表达。此外,mcherry-EGFP-LC3B质粒转染,检测沉默FoxO3a之后自噬小体的数目变化情况,后通过透射电镜进一步观察软骨细胞的超微结构变化。4.酸处理(pH 6.0)大鼠关节软骨细胞不同时间,Western blot检测AMPKα的磷酸化水平。预处理ASIC1a特异性阻断剂PcTx1和钙螯合剂BAPTA-AM后,Western blot检测AMPK的磷酸化情况。然后,转染AMPKαsiRNA,利用Western blot分析确定下游FoxO3a的表达水平及自噬相关蛋白的表达。进一步应用AMPK抑制剂,复合物C(Compound C)预处理,qRT-PCR和Western blot法检测FoxO3a和自噬相关基因及蛋白的表达。此外,通过转染EGFP-LC3质粒,观察荧光点聚集情况变化。结果1.胞外酸化诱导了大鼠关节软骨细胞的自噬Western blot结果显示,LC3B-II和Beclin1蛋白在pH 6.0处理3 h后蛋白表达显著增加。qRT-PCR分析也表明,关节软骨细胞LC3,Beclin1和ATG5 mRNA的表达在3 h时最为明显。***1a促进大鼠关节软骨细胞酸诱导的自噬,且与[Ca]增加有关酸处理可增加大鼠关节软骨细胞ASIC1a的蛋白表达。在关节软骨细胞的质膜中观察到ASIC1a的免疫荧光细胞染色,并且其在酸处理的细胞中表达增加。激光共聚焦结果表明酸化刺激(pH 6.0)使胞内的钙离子显著增加。而在应用ASIC1a特异性阻断剂PcTx1和钙螯合剂BAPTA-AM预处理后,可显著降低酸刺激时细胞内钙的浓度。用ASIC1a特异性阻断剂PcTx1和钙螯合剂BAPTA-AM预处理可明显抑制自噬相关蛋白LC3B-II,Beclin1的表达。单丹磺酰尸胺(MDC)染色显示,与对照组相比,酸处理3小时的细胞在细胞质中显示出相当大量的自噬泡,然而,在用抑制剂预处理的关节软骨细胞中自噬泡数目明显减少。以上结果表明,活化的ASIC1a促进大鼠关节软骨细胞的自噬,这与课题组前期的研究相一致。3.转录因子FoxO3a在ASIC1a介导的大鼠关节软骨细胞的自噬中发挥关键作用胞外酸化(pH 6.0)刺激可增加FoxO3a的表达,并且使其核内表达水平增加约两倍,同时免疫荧光结果显示,酸处理可使大鼠关节软骨细胞内FoxO3a表达增加。然而,用ASIC1a特异性阻断剂PcTx1和钙螯合剂BAPTA-AM预处理可减少酸诱导的胞内FoxO3a的蛋白表达。用siRNA沉默FoxO3a可显著降低酸诱导的LC3B-II,Beclin1和ATG5基因和蛋白的表达。在用mCherry-EGFP-LC3B质粒瞬时转染大鼠关节软骨细胞后,与对照相比,酸处理明显提高了自噬溶酶体数目,然而敲除FoxO3a基因减少了酸诱导形成的自噬小体。透射电镜结果亦是如此。这些表明ASIC1a促进了FoxO3a的激活,并且FoxO3a信号的激活在ASIC1a介导的大