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大肠杆菌Nissle 1917鞭毛蛋白FliC的结构特性及刺激Caco-2细胞作用研究

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饲料研究 2023年

作者：李双杨泽敏廖义潇杨颖贵州大学动物疫病研究所贵州大学动物科学学院

旨在分析大肠杆菌Nissle 1917 鞭毛蛋白FliC(FliCEcN)的结构特征及其对Caco-2细胞的刺激作用。试验通过大肠杆菌BL21(DE3)表达FliCEcN蛋白、经NTA柱纯化FliCEcN蛋白并通过SDS-PAGE和Western-blot验证，接着利用SOPMA和Alphofold2预测FliCEcN蛋白的结构模型、表面增强拉曼光谱和圆二色谱解析FliCEcN蛋白的结构，最后将FliCEcN蛋白刺激Caco-2细胞后检测免疫相关因子的分泌水平。结果表明：FliCEcN蛋白的大小为64 kDa，能够被抗His单克隆抗体特异识别；FliCEcN蛋白的氨基和羧基末端主要由α-螺旋组成，中间结构域主要由β-折叠组成；FliCEcN蛋白酰胺Ⅰ区最大吸收峰均位于1656 cm-1处，主要二级结构为α-螺旋和β-折叠；FliCEcN的α-螺旋占比44.4%、β-折叠占比23.4%、β-转角占比13.5%、无规则卷曲占比19%；FliCEcN蛋白有效刺激Caco-2细胞分泌IL-6、IL-10、TNF-α，随着刺激时间增加，IL-6的分泌水平呈下降趋势、IL-10和IFN-α的分泌水平呈增加趋势。结论：α-螺旋和β-折叠是构成FliCEcN的主要结构，可促进其构象的正确折叠和维持其三维结构稳定；FliCEcN蛋白刺激Caco-2细胞分泌IL-6、IL-10、TNF-α的水平存在差异。

关键词：大肠杆菌Nissle 1917 鞭毛蛋白表面增强拉曼光谱圆二色谱生物学活性

益生菌大肠杆菌Nissle 1917的新型基因表达平台构建与应用

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益生菌大肠杆菌Nissle 1917的新型基因表达平台构建与应用

作者：赵琳琳江南大学

学位级别：硕士

作为代谢工程中应用最多的异源蛋白表达宿主,大肠杆菌具有遗传背景清晰、蛋白表达能力强、培养成本低等优点。大肠杆菌Nissle 1917(EcN)被用作非处方益生菌药物已有超过100年的历史,它具有增强肠道免疫功能,保护肠黏膜屏障,抑制病理性... 详细信息

作为代谢工程中应用最多的异源蛋白表达宿主,大肠杆菌具有遗传背景清晰、蛋白表达能力强、培养成本低等优点。大肠杆菌Nissle 1917(EcN)被用作非处方益生菌药物已有超过100年的历史,它具有增强肠道免疫功能,保护肠黏膜屏障,抑制病理性炎症等功能。EcN作为益生菌药物的商业使用使其在生物安全性方面优于大肠杆菌常用菌株BL21(DE3)和MG1655。本研究通过对EcN基本性能的表征以及对启动子元件和EcN内源隐性质粒的开发,构建了基于益生菌EcN的新型基因表达平台。主要的研究结果如下:(1)EcN与大肠杆菌菌株BL21(DE3)和MG1655比较分析。我们在不同条件下培养了EcN、BL21(DE3)和MG1655,发现EcN在无机盐培养基中生长具有一定的优势,而副产物乙酸产量低于MG1655。比较基因组学和转录组数据表明,EcN拥有1404个独有的编码序列(CDSs),对其独有的CDSs进行分类表明:EcN具有额外的VI型分泌系统,精氨酸脱氨途径,铁转运系统等。我们的实验也证明了EcN对低铁离子浓度的环境更具有耐受性。通过表达异源荧光蛋白GFP,EcN的蛋白表达水平低于BL21(DE3)和MG1655,这为我们提供了将EcN用于代谢工程宿主的一个改造方向。(2)EcN内源启动子表征以及人工合成启动子构建。基于转录组数据对EcN转录组表达量最高的前30个基因启动子强度进行了表征。之后根据σ和σ结合位点设计了人工合成启动子,并通过流式细胞仪和摇瓶筛选最终得到了肝素裂解酶BhepⅢ和GFP强度分别比J23119强度高20%和35%的组成型启动子,以及一系列梯度强度的启动子。(3)隐性质粒敲除菌株的构建。鉴于隐性质粒pMUT1和pMUT2的存在可能对异源质粒或是重组隐性质粒的表达造成干扰,我们基于CRISPR/Cas9对隐性质粒进行敲除,分别得到了敲除了单个质粒的EcNΔP1(敲除质粒pMUT1)和EcNΔP2(敲除质粒pMUT2)。将pMUT1-amp 转入EcNΔP2,通过不断增加抗生素浓度,使pMUT1-amp完全取代内源pMUT1。pMUT1-amp 质粒基于CRISPR/Cas9进行敲除,进而得到了EcNΔP12(同时敲除质粒pMUT1和pMUT2)。(4)EcN隐性质粒截短表征。分别对pMUT1和pMUT2进行截短表征,获得了14个隐性质粒重组质粒,分析了重组质粒上各个元件的删除对于菌体生长、质粒拷贝数、蛋白表达强度以及传代稳定性的影响。在不添加抗生素的条件下传代培养,隐性质粒衍生质粒最多可以在宿主菌中稳定存在13天。(5)将隐性质粒截短质粒与合成启动子同时应用于肝素裂解酶BhepⅢ的生产,最终pMUT1衍生质粒BhepⅢ的酶活是对照菌株的2.16倍,pMUT2衍生质粒BhepⅢ的酶活是对照菌株的1.4倍。

关键词：大肠杆菌Nissle 1917 启动子 σ因子隐性质粒无抗生素表达

采用CRISPRi原位探索大肠杆菌Nissle 1917毒素-抗毒素功能研究

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采用CRISPRi原位探索大肠杆菌Nissle 1917毒素-抗毒素功能研究

作者：李品毅浙江工商大学

学位级别：硕士

大肠杆菌 nissle1917(E.colinissle 1917,EcN 1917)是食品与药物应用中常见的一种肠道益生菌。与常规大肠杆菌相比,在治疗胃肠道疾病方面有重要活性或应用。本文以EcN 1917为对象,通过基因组毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxin system,TA... 详细信息

大肠杆菌 nissle1917(E.colinissle 1917,EcN 1917)是食品与药物应用中常见的一种肠道益生菌。与常规大肠杆菌相比,在治疗胃肠道疾病方面有重要活性或应用。本文以EcN 1917为对象,通过基因组毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxin system,TA)预测、序列比较以及基因结构生物信息学分析毒素-抗毒素基因的结构功能。通过毒素-抗毒素基因在E.coliBL21中的异源表达以及在EcN 1917中的原位敲低(knockdown),阐释了毒素-抗毒素基因和hipA对EcN 1917生物膜以及持留细胞形成的影响。生物信息学分析表明,EcN 1917基因组含有10对毒素-抗毒素系统,多数为Type 11。软件预测基因序列(52351-52901bP,命名为PP0551)这段序列为假定mazEF序列且得分最高。经进一步基因克隆及测序,EcN 1917中PP0551序列大小为551bp,PP0240(mazE)序列在PP024(mazF)相邻的上游,中间仅隔CG两个碱基,共用一个启动子,为典型的双顺反子结构基因结构;且PP0551基因序列与其它非益生性大肠杆菌的mazEF的基因序列结构完全一致。目标在大肠杆菌BL21克隆表达试验结果(生长曲线和平板点样生长)也表明,其基因产物活性完全符合Type Ⅱ TA系统特片。因此,我们确定PP0551序列为mazEF毒素-抗毒素系统,并将其命名为mazEF-EcN。通过其读码框上下游基因比较分析,发现mazEFcN与其他的大肠杆菌mazEF的侧翼基因结构完全相同,可推断mazEF在大肠杆菌种水平的高保守性及水平遗传进化属性。为进一步探索TA系统对于EcN 1917益生特性的调控机制,在此我们采用CRISPRi技术进行了原位敲低试验。依据mazEF,hipA基因序列,采用CRISPRdirect设计并合成gRNA片段,与载体连接后构建了转化质粒;再分别引入mazEF-gsRNA/dCas9和hipA-gsRNA/dCas9质粒。EcN 1917转化子EcN-AmazE与EcN-△hipA经诱导后,RT-PCR检测及PAGE试验结果表明mazEF及hipA的表达都分别被抑制。与之同时,EcN 1917持留和生物膜形成都显著降下。当除去诱导剂后,mazEF及hipA的表达恢复正常。相比常规基因敲除与回补试验过程,CRISPRi技术大大简化了操作过程,可快速实现基因表达与原位敲低比较,为研究EcN 1917的TA生理功能提供了一种十分有价值的工作思路;此外,mazEF及hipA对EcN 1917持留和生物膜的调控为此后开发EcN 1917的益生特征,尤其是提高其在肠道中的存活和粘附能力,具有重要的指导意义。

关键词：大肠杆菌Nissle 1917 毒素-抗毒素系统 mazEF hipA CRISPRi

猪源大肠杆菌nissle1917株的分离鉴定及其作为口服疫苗载体菌的初步评估

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猪源大肠杆菌Nissle1917株的分离鉴定及其作为口服疫苗载体菌的初...

作者：张伟扬州大学

学位级别：硕士

大肠杆菌Nissle 1917是由德国科学家Alfred nissle于1917年发现的一种益生菌,其血清型为O6:K5:H1,它可以在肠道定植,维持肠道菌群平衡,刺激肠道免疫组织产生免疫球蛋白和细胞因子,对肠道粘膜免疫具有重要的作用。在国外nissle1917已批... 详细信息

大肠杆菌Nissle 1917是由德国科学家Alfred nissle于1917年发现的一种益生菌,其血清型为O6:K5:H1,它可以在肠道定植,维持肠道菌群平衡,刺激肠道免疫组织产生免疫球蛋白和细胞因子,对肠道粘膜免疫具有重要的作用。在国外nissle1917已批准临床应用于人,小鼠和牛,由于对猪的益生作用还需进一步的验证,因此临床尚未应用。目前国内还没有此方面的任何报道。细菌载体疫苗是将编码靶抗原或病原体特异性抗原的DNA片段插入减毒病原菌或者共生菌,并在其中有效表达和向体内免疫系统提呈表达的抗原,有效激发机体的免疫应答,以期达到预防一种或多种疾病的作用。由于作为载体菌的减毒病原菌存在一定的毒力返强风险,益生菌作为蛋白或抗原的释放载体成为新的研究亮点。随着益生菌载体菌蛋白表达技术的成熟,大肠杆菌Nissle 1917作为口服疫苗安全活菌载体具有广阔的应用前景。本实验旨在证实大肠杆菌Nissle 1917株作为肠道共生菌存在于猪体内,并从猪体内分离鉴定出此菌,通过绿色荧光蛋白探索猪源nissle 1917在小鼠体内的定植,并检测经小鼠口服菌体表面表达粘附素fedF的重组菌nissle 1917-fedF后的免疫应答相关参数。 Gabriele等依据人源性大肠杆菌Nissle 1917的I型菌毛亚单位fimA、F1C菌毛亚单位focA和两个质粒pMUT1﹑ pMUT2的基因序列设计出5对特异性的PCR引物用于检测人源性大肠杆菌Nissle 1917,Kleta等用这五对PCR引物同样能够从猪肠道粪便制备的DNA样品中检测到nissle 1917。本试验是以实验室保存的人源大肠杆菌Nissle 1917为阳性参考菌株,采集不同品种、不同日龄健康断奶仔猪的新鲜粪便制备的DNA135份,用上述5对引物对DNA样品进行PCR扩增,结果显示从其中的两份DNA样品中扩增出与上述五对PCR引物预期大小相符的5个特异性目的片段,初步认为该两份样品存在猪源大肠杆菌Nissle 1917。基于上述阳性假设,将扩增的427bp大小的pMUT2（a）目的片段,经PCR产物纯化,T载体连接、克隆、重组质粒DNA大量扩增,纯化回收pMUT2目的片段,用非同位素地高辛随机引物标记法制成DNA探针,该探针特异性高,敏感度达16pg。通过菌落原位杂交的方法从上述两份阳性粪便样品中分别筛选出2株阳性菌落,最后通过血清学检验、PCR扩增和目的片段的克隆测序进一步鉴定为阳性菌株。构建表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组菌猪源nissle 1917-GFP和表达F18ab亚单位fedF的重组菌nissle 1917-fedF,重组菌nissle 1917-GFP在紫外灯下可发出绿色荧光,而nissle 1917-fedF在厌氧条件下诱导培养可在菌体表面表达大肠杆菌黏附素F18的亚单位fedF。经多次口服免疫ICR小鼠,检测重组菌在小鼠体内肠道的定植时间和外周血液样本中抗fedF特异性IgG水平。检测结果显示nissle 1917-fedF比nissle 1917-GFP在小鼠肠道内的存留时间长24h。nissle 1917-FedF组在初免后14天产生了抗fedF的IgG抗体,第33天的抗体水平明显升高。而nissle1917和nissle 1917-GFP组均未检测到抗fedF的IgG抗体。本实验为nissle 1917载体菌口服疫苗的研制和仔猪腹泻病的防治提供新的可能途径和奠定一定的研究基础。

关键词：大肠杆菌Nissle 1917 益生菌重组菌绿色荧光蛋白 F18ab亚单位fedF

表达Elafin的益生菌nissle 1917对小鼠实验性结肠炎的保护作用

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中华医学杂志 2021年第46期101卷 3819-3824页

作者：刘子麟王蔚虹刘芸吴婷滕贵根北京大学第一医院消化内科北京100034

目的构建能够表达人重组蛋白Elafin的益生菌大肠杆菌Nissle 1917(EcN),并探讨其对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的急性小鼠结肠炎的保护作用。方法构建带有Elafin基因的重组质粒,将其转入感受态EcN,构建能够表达Elafin蛋白的益生菌EcN-Elafin... 详细信息

目的构建能够表达人重组蛋白Elafin的益生菌大肠杆菌Nissle 1917(EcN),并探讨其对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的急性小鼠结肠炎的保护作用。方法构建带有Elafin基因的重组质粒,将其转入感受态EcN,构建能够表达Elafin蛋白的益生菌EcN-Elafin。通过Western印迹证实该益生菌在体外成功表达Elafin。C57/BL6J小鼠随机分为4组:健康对照组(PBS组)、结肠炎组(DSS组)、野生型EcN(EcN-WT)治疗结肠炎组(EcN-WT组)、EcN-Elafin治疗结肠炎组(EcN-Elafin组)。每天同一时间测量小鼠体重、观察小鼠排便情况及计算疾病活动度指数(DAI)。小鼠处以安乐死后测量结肠长度,苏木精-伊红(HE)染色及组织病理学评分比较各组肠黏膜炎症程度,流式细胞术检测结肠固有层浸润中性粒细胞和巨噬细胞的比例,酶联免疫吸附法(ELISA)定量结肠组织中的肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6及趋化因子CXCL-1的蛋白表达水平。结果在EcN-Elafin的培养基上清和菌体沉淀中均能检测到Elafin蛋白。与DSS组相比,EcN-Elafin组和EcN-WT组小鼠体重减轻状况和DAI评分均明显改善。EcN-Elafin组小鼠结肠长度显著长于DSS组。EcN-Elafin组结肠炎组织学评分显著低于DSS组(5.3±2.3比9.3±1.4,P<0.05)。与DSS组小鼠相比,EcN-Elafin组小鼠结肠固有层浸润的中性粒细胞[(8.65±1.49)%比(17.60±2.16)%,P<0.01]和巨噬细胞[(3.79±0.26)%比(5.73±0.45)%,P<0.01]比例均显著降低。EcN-Elafin组和EcN-WT组结肠中TNF-α、IL-6、和CXCL-1蛋白质表达水平均显著低于DSS组。结论表达Elafin的益生菌EcN-Elafin能够显著减轻DSS诱导的急性小鼠结肠炎,对肠黏膜炎症具有保护作用,为临床炎症性肠病的治疗提供一种新的经济有效的方法。

关键词：结肠炎实验性结肠炎大肠杆菌Nissle 1917 弹力素炎症性肠病

基因工程改造大肠杆菌产L-5-甲基四氢叶酸的研究

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基因工程改造大肠杆菌产L-5-甲基四氢叶酸的研究

作者：李乐馨山东大学

学位级别：硕士

叶酸(Folic acid)属于B族维生素,其代谢产物在DNA合成及甲基化、一碳单位代谢和蛋白质代谢等方面发挥重要作用,其中,L-5-甲基四氢叶酸(L-5-MTHF)是叶酸经过多步酶促反应后生成的唯一可以穿过血脑屏障而发挥作用的物质,已被广泛用于各种... 详细信息

叶酸(Folic acid)属于B族维生素,其代谢产物在DNA合成及甲基化、一碳单位代谢和蛋白质代谢等方面发挥重要作用,其中,L-5-甲基四氢叶酸(L-5-MTHF)是叶酸经过多步酶促反应后生成的唯一可以穿过血脑屏障而发挥作用的物质,已被广泛用于各种疾病的预防和治疗,具有广阔的市场前景。目前,对L-5-MTHF生物合成法的研究主要集中在以乳酸菌和枯草芽孢杆菌为底盘细胞的代谢工程设计上,而以大肠杆菌(Escherichia coli)为底盘细胞生产L-5-MTHF的研究较少。本实验室前期通过引入Clostridium autoethanogenum DSM 10061的Wood-Ljungdahl途径(WLP途径)中三个酶编码的基因,甲酸-四氢叶酸连接酶(fhs)、甲酰四氢叶酸环水解酶(fchA)和亚甲基四氢叶酸脱氢酶(folD)并过表达大肠杆菌自身的二氢叶酸还原酶(folA)和亚甲基四氢叶酸还原酶(metF),成功地在E.coli BL21(DE3)中构建了一条新的L-5-MTHF合成途径,使其产量大幅提高。在此基础上,本论文通过替换关键酶、筛选启动子和优化RBS序列,调控外源基因的表达,以进一步提高L-5-MTHF的产量。同时,考虑到利用微生物生产L-5-MTHF包括发酵和纯化提取等多个步骤,制备过程繁琐,成本较高,故本论文也尝试将底盘细胞更换为能定植于肠道的益生菌E.coli nissle 1917(EcN),以期实现不纯化目标产物而直接应用该工程化益生菌的目标。主要的研究成果如下:一、通过序列比对及酶活测定筛选关键酶并用于工程菌改造,替换亚甲基四氢叶酸脱氢酶(FolD)的工程菌BL21-D中L-5-MTHF产量高于出发菌株,说明提高FolD活性能够在一定程度上解除目标产物合成的限速步骤。利用质粒pET28b(+)在E.coliBL21(DE3)中对来自Blautiaproducta的亚甲基四氢叶酸还原酶(BpMTHFR)和亚甲基四氢叶酸脱氢酶(BpFolD)进行异源表达和纯化,检测到BpMTHFR和BpFolD的特异性酶活(分别为37.791±3.95 U·mg-1和378.65±7.01 U·mg-1),说明这两个酶具有良好活性并可应用于工程菌的改造。以实验室前期构建的产L-5-MTHF的工程菌E.coli BL21-WL为出发菌株,用上述两个酶的编码基因替换出发菌株相应酶的基因,构建了三株工程菌,诱导发酵后采用高效液相色谱法检测L-5-MTHF的产量,替换还原酶的工程菌B L21-R产量为315.94 μg·L-1,替换脱氢酶的工程菌BL21-D产量为483.53 μg·L-1,两酶均替换的工程菌产量为363.26μg·L-1,其中BL21-D与出发菌株相比产量提高了 37.34%,选用高活性的FolD更有利于目标产物L-5-MTHF的合成。二、对工程菌E.coli BL21-WL中外源基因的表达进行了启动子筛选与RBS序列优化,对比出发菌株,工程菌BL21-RBS6产量提高了 60.85%,实现了 L-5-MTHF合成途径相关基因的精细化调控。以pETDuet-1质粒为骨架,选取lac和trc启动子替换质粒上原有的T7启动子起始基因fhs、fchA和folD转录,将构建的工程菌诱导发酵,测定L-5-MTHF的产量,发现与出发菌株相比工程菌BL21-99A的产量提高了 37.57%,确定trc启动子更适于目标基因的表达。进一步从MIT Registry of Biological Standard Parts数据库中选取三个不同强度的RBS序列,通过融合PCR技术将不同的RBS序列分别与基因fhs、fchA和folD相连,获得6株不同基因表达强度的工程菌,诱导发酵后通过分析工程菌粗酶液中蛋白表达情况判断外源基因的翻译水平,结合L-5-MTHF的产量选取最优RBS序列组合方式,发现利用强、弱、中RBS序列分别调控基因fhs、fchA和folD是比较理想的组合方式。三、通过基因组改造和质粒表达的方法,将L-5-MTHF合成途径引入益生菌EcN中,得到可合成L-5-MTHF的益生菌EcN-99A。以益生菌EcN为底盘细胞,将原本在pACYCDuet-1上过表达的基因metF和folA整合到基因组上进行表达,使用Red同源重组的方法将两基因的启动子替换为组成型强启动子Ptip以降低多质粒过表达给细胞带来的生长压力,同时将前期设计并优化的L-5-MTHF合成线路转入EcN中,诱导发酵后检测L-5-MTHF的产量,最终得到产L-5-MTHF的益生菌EcN,产量达到316.27μg·L-1。综上所述,本论文从关键酶、启动子和RBS序列等方面优化外源基因fhs、fchA和folD的表达,以筛选出最优的组合方式,创新性地将L-5-MTHF的合成途径引入益生菌EcN中,以期将来通过直接使用益生菌实现L-5-MTHF的外源补充。该方

关键词： L-5-甲基四氢叶酸启动子 RBS序列大肠杆菌Nissle 1917

口服益生菌对小鼠感染沙门氏菌的保护作用研究

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口服益生菌对小鼠感染沙门氏菌的保护作用研究

作者：周洋吉林农业大学

学位级别：硕士

沙门氏菌病是导致人类死亡的三大主要原因,是最重要的食源性疾病之一。动物是沙门氏菌的主要来源,而动物性食品是向人类传播的主要途径。因此,从源头来控制这种疾病的感染有助于未来在全球范围内对整个食物链中沙门氏菌进行有效控制和... 详细信息

沙门氏菌病是导致人类死亡的三大主要原因,是最重要的食源性疾病之一。动物是沙门氏菌的主要来源,而动物性食品是向人类传播的主要途径。因此,从源头来控制这种疾病的感染有助于未来在全球范围内对整个食物链中沙门氏菌进行有效控制和防控。在很早的研究中显示,最开始人们使用抗生素来预防并治疗沙门氏菌。在一开始确实初见疗效,但副作用很大。随着时间的发展,沙门氏菌也在不停的进化。由于人们对以抗生素治疗沙门氏菌的执著,不断变换抗生素种类,迄今为止,沙门氏菌已经进化出多种耐药的血清型。因此抗生素替代物的研究备受重视,益生菌就是其中一种,益生菌中的大肠杆菌Nissle 1917（Ec N）因其独特的适应属性和对宿主的安全性在对致病菌竞争时表现出巨大的优势。本研究选择了使用较为广泛的益生菌大肠杆菌Nissle 1917,首先给予小鼠口服大肠杆菌Nissle 1917,之后对各组小鼠进行沙门氏菌攻菌。攻菌后观察小鼠肝脏、脾脏和肠道病理变化,检测肝脏活菌数量,记录小鼠的幸存率。通过观察小鼠各组织的石蜡切片可发现nissle 1917能够显著减轻沙门氏菌对小鼠组织的损伤;对小鼠肝脏进行沙门氏菌活菌计数,结果显示nissle 1917能够减少沙门氏菌对小鼠肝脏的入侵;此外,通过小鼠体重和存活曲线可以看出,菌株nissle 1917对小鼠感染沙门氏菌具有保护作用。本实验证实了益生菌可以改变感染沙门氏菌小鼠肠道菌群。给予小鼠口服益生菌之后攻菌。采集感染小鼠粪便后进行16S扩增子测序。结果显示两组小鼠肠道菌群结构均发生了改变。Romboutsia菌属、抑杆菌科和梭菌科丰度下降说明沙门氏菌感染可能导致了小鼠肠粘膜的病变。其中乳杆菌科、毛螺菌科、瘤胃菌科的丰度显著上升,说明益生菌能够促进肠道中的乳杆菌增殖。以上实验结果证明,本研究中使用的大肠杆菌Nissle 1917对感染沙门氏菌小鼠有保护作用,可以用作微生态制剂候选菌株。

关键词：大肠杆菌Nissle 1917 小鼠沙门氏菌高通量测序

转化产甲酸草酸杆菌Frc基因于大肠杆菌及其表达的实验研究

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转化产甲酸草酸杆菌Frc基因于大肠杆菌及其表达的实验研究

作者：赖德辉广州医学院

学位级别：硕士

【目的】将产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes,OF)代谢草酸基因Frc克隆到表达载体PGEX-4T-2,以此载体转化益生菌大肠杆菌Nissle 1917(E.coli nissle 1917,EcN),观察其目的蛋白代谢草酸相关性酶--甲酰辅酶A转移酶(Formyl-CoA Transferase,FCoAT)的稳定表达,获得具有代谢草酸潜能的EcN。【方法】YQX-II型厌氧工作站内,改良MRS培养基培养OF,革兰氏染色,细菌学形态及特异核酸序列检测鉴定。以OF基因组DNA为模板,PCR扩增目的基因Frc,构建测序质粒pMD? 19-T-Frc,氯化钙法转化大肠杆菌感受态JM109,挑选单克隆,测序blast比对,选择与GenBank(U82167.1)完全一致的单克隆。经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切pMD? 19-T-Frc,和原核表达载体PGEX-4T-2,产物纯化后进行连接反应,构建成原核表达质粒PGEX-4T-2-Frc,酶切电泳鉴定分析,测定序列正确。氯化钙法转化感受态EcN,转化后AMP(100mg/L)LB平板筛选,得到大肠杆菌Nissle 1917-Frc(E.coli nissle 1917-Frc,EcN-Frc)。以终浓度为1.0mmol/L IPTG诱导培养EcN-Frc,于0,2,4,6,8,10小时,分别留取菌体和菌液。提取菌体中蛋白。ELISA检测培养基上清和菌体的融合蛋白GST- FCoAT。诱导0,1,2,3,4,5,6小时,分别留取菌体和菌液,以50ug总蛋白行western-blot鉴定分析,证明FCoAT的表达。【结果】改良MRS培养基厌氧培养OF成功,LB培养EcN成功。基因扩增OF基因组,电泳结果:1300bp位置出现Frc特异条带,测序确定序列与GenBank(U82167.1)完全一致。质粒PGEX-4T-2-Frc,酶切鉴定,可在1300bp和4900bp见特异条带,前者为Frc,后者为线性PGEX-4T-2,移码框阅读顺序正确,测序结果与前一致。western-blot:EcN-Frc在1.0mmol/L IPTG诱导后,于75KD左右可见蛋白表达条带,融合蛋白GST-FCoAT,且ELISA结果显示其在EcN-Frc上清及菌体中均有表达。且上清的表达水平高于菌体的沉淀中的水平。【结论】克隆Frc基因,构建了该基因的原核表达载体PGEX-4T-2-Frc。益生菌的大肠杆菌EcN,通过基因工程手段作为载体成功携带Frc基因,并表达FCoAT,成为具有代谢草酸潜能的新型益生大肠杆菌EcN,将为下一步体外及体内代谢草酸实验提供原料,并有望成为临床治疗高草酸尿和防治草酸结石的更适合口服的益生菌制剂。

关键词：产甲酸草酸杆菌甲酰辅酶A转移酶基因克隆大肠杆菌Nissle 1917