转化产甲酸草酸杆菌Frc基因于大肠杆菌及其表达的实验研究

作     者：赖德辉 

作者单位：广州医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：李逊

授予年度：2010年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：产甲酸草酸杆菌 甲酰辅酶A转移酶 基因克隆 大肠杆菌Nissle 1917 

摘      要：【目的】将产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes,OF)代谢草酸基因Frc克隆到表达载体PGEX-4T-2,以此载体转化益生菌大肠杆菌Nissle 1917(*** Nissle 1917,EcN),观察其目的蛋白代谢草酸相关性酶--甲酰辅酶A转移酶(Formyl-CoA Transferase,FCoAT)的稳定表达,获得具有代谢草酸潜能的EcN。 【方法】YQX-II型厌氧工作站内,改良MRS培养基培养OF,革兰氏染色,细菌学形态及特异核酸序列检测鉴定。以OF基因组DNA为模板,PCR扩增目的基因Frc,构建测序质粒pMD? 19-T-Frc,氯化钙法转化大肠杆菌感受态JM109,挑选单克隆,测序blast比对,选择与GenBank(U82167.1)完全一致的单克隆。经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切pMD? 19-T-Frc,和原核表达载体PGEX-4T-2,产物纯化后进行连接反应,构建成原核表达质粒PGEX-4T-2-Frc,酶切电泳鉴定分析,测定序列正确。氯化钙法转化感受态EcN,转化后AMP(100mg/L)LB平板筛选,得到大肠杆菌Nissle 1917-Frc(*** Nissle 1917-Frc,EcN-Frc)。以终浓度为1.0mmol/L IPTG诱导培养EcN-Frc,于0,2,4,6,8,10小时,分别留取菌体和菌液。提取菌体中蛋白。ELISA检测培养基上清和菌体的融合蛋白GST- FCoAT。诱导0,1,2,3,4,5,6小时,分别留取菌体和菌液,以50ug总蛋白行western-blot鉴定分析,证明FCoAT的表达。 【结果】改良MRS培养基厌氧培养OF成功,LB培养EcN成功。基因扩增OF基因组,电泳结果:1300bp位置出现Frc特异条带,测序确定序列与GenBank(U82167.1)完全一致。质粒PGEX-4T-2-Frc,酶切鉴定,可在1300bp和4900bp见特异条带,前者为Frc,后者为线性PGEX-4T-2,移码框阅读顺序正确,测序结果与前一致。western-blot:EcN-Frc在1.0mmol/L IPTG诱导后,于75KD左右可见蛋白表达条带,融合蛋白GST-FCoAT,且ELISA结果显示其在EcN-Frc上清及菌体中均有表达。且上清的表达水平高于菌体的沉淀中的水平。 【结论】克隆Frc基因,构建了该基因的原核表达载体PGEX-4T-2-Frc。益生菌的大肠杆菌EcN,通过基因工程手段作为载体成功携带Frc基因,并表达FCoAT,成为具有代谢草酸潜能的新型益生大肠杆菌EcN,将为下一步体外及体内代谢草酸实验提供原料,并有望成为临床治疗高草酸尿和防治草酸结石的更适合口服的益生菌制剂。