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中华医学遗传学杂志 2012年第4期29卷 431-434页

作者：张印峰罗海宁黎小佩张云山天津市中心妇产科医院生殖中心 300052 天津医科大学

多重置换扩增是一种新兴的全基因组扩增技术，能对单个细胞进行全基因扩增，产生大量的优质DNA，具有高扩增效率和高保真性等特点。多重置换扩增联合常规PCR已被成功用于植入前遗传学诊断，进一步扩展了后者的应用范围。

关键词：多重置换扩增植入前遗传学诊断全基因组扩增

多重置换扩增方法在无创性产前基因诊断中的应用

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中华医学遗传学杂志 2007年第2期24卷 196-199页

作者：刘维瑜金春莲刘丽英林长坤王雁孙开来中国医科大学基础医学院医学遗传学教研室沈阳110001 中国医科大学基础医学院实验技术中心三部沈阳110001

目的探讨多重置换扩增（multiple displacement amplification，MDA）方法应用到杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）的无创性产前基因诊断中的可行性。方法对12例孕7～25周的孕妇外周血用Pcreoll不连续密度梯度离心初... 详细信息

目的探讨多重置换扩增（multiple displacement amplification，MDA）方法应用到杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）的无创性产前基因诊断中的可行性。方法对12例孕7～25周的孕妇外周血用Pcreoll不连续密度梯度离心初步富集、甩片后，用Kleihauer抗酸染色法标记胎儿有核红细胞。显微操作法获取阳性细胞后，进行多重置换扩增，得到的全基因组扩增产物直接作为模板进行性别鉴定及短串联重复序列连锁分析检测，验证有核红细胞的来源，同时进行DMD的无创性产前基因诊断。结果经多重置换扩增后的产物进行琼脂糖电泳，显示片段长度大于15kb。应用多重置换扩增方法对12例孕有DMD高风险患儿的孕妇进行了无创性产前基因诊断，诊断结果与引产或产后反馈相一致。结论多重置换扩增能从微量模板中扩增出大量均一、完整的胎儿基因组序列，确保了无创性产前基因诊断结果的准确性。

关键词：无创性产前基因诊断有核红细胞多重置换扩增

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多重置换扩增技术及其法医学应用展望

中国法医学杂志 2012年第5期27卷 379-382页

作者：杨华昕丁梅王保捷庞灏姜航航刘欣中国医科大学法医学院辽宁沈阳110001

多重置换扩增技术(multiple displacement amplification,MDA)是一种新型的全基因组扩增技术,具有操作简单、产物质量好、产物量稳定和扩增较均衡的优点,可以扩增低拷贝、混合、降解、含抑制物的DNA检材,为后续分析提供良好的高质量的... 详细信息

多重置换扩增技术(multiple displacement amplification,MDA)是一种新型的全基因组扩增技术,具有操作简单、产物质量好、产物量稳定和扩增较均衡的优点,可以扩增低拷贝、混合、降解、含抑制物的DNA检材,为后续分析提供良好的高质量的扩增产物,在法医物证学领域具有很大的应用潜力,本文对该项技术的研究进展及应用前景进行综述。

关键词：法医物证学全基因组扩增多重置换扩增

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多重置换扩增在植入前胚胎性别诊断中的应用

中国现代医学杂志 2013年第17期23卷 48-53页

作者：宋学茹白晓红吕永焕张颖天津医科大学总医院生殖医学中心妇产科天津300052

目的用多重置换扩增(MDA)方法,对植入前胚胎的单个卵裂球全基因组扩增后进行植入前胚胎性别的遗传学诊断。方法用单细胞多重置换扩增方法对20个胚胎共20个单卵裂球进行全基因组扩增,用荧光PCR检测SRY、AMEL、XHPRT及X22 4个性别相关的... 详细信息

目的用多重置换扩增(MDA)方法,对植入前胚胎的单个卵裂球全基因组扩增后进行植入前胚胎性别的遗传学诊断。方法用单细胞多重置换扩增方法对20个胚胎共20个单卵裂球进行全基因组扩增,用荧光PCR检测SRY、AMEL、XHPRT及X22 4个性别相关的基因座,检测胚胎性别,同时用同一胚胎另一卵裂球FISH结果作为对照。结果 20个卵裂球MDA均扩增成功,扩增成功率100%。20个胚胎均得到诊断,性别诊断成功率100%,其中12例为男性胚胎,8例为女性胚胎,与FISH结果一致率100%,诊断准确率100%。结论可以用单卵裂球MDA后荧光PCR检测多个基因座的方法对胚胎性别进行快速、准确的植入前诊断。

关键词：植入前遗传学诊断多重置换扩增 STR分型荧光PCR 性别检测

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多重置换扩增在含抑制物检材中的应用

法医学杂志 2016年第5期32卷 342-345页

作者：丁东雪丁梅中国医科大学法医学院法医血清教研室辽宁沈阳110001

目的研究多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)在含抑制物检材中的抗抑制能力,与磁珠法纯化检材相比较,证明其在法医学中的应用及意义。方法将不同浓度血红素和腐殖酸与样本DNA进行混合,分为MDA处理组、磁珠法处理组... 详细信息

目的研究多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)在含抑制物检材中的抗抑制能力,与磁珠法纯化检材相比较,证明其在法医学中的应用及意义。方法将不同浓度血红素和腐殖酸与样本DNA进行混合,分为MDA处理组、磁珠法处理组和空白对照组,PCR-STR单基因座D3S1358扩增联合聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,并应用Amp F詛STR誖IdentifilerTMPlus试剂盒联合毛细管电泳检测。结果血红素质量浓度大于1 ng/μL或腐殖酸质量浓度大于0.1 ng/μL时,空白对照组经单基因座STR检测不能得到扩增产物;磁珠法处理组血红素质量浓度大于100 ng/μL或腐殖酸浓度大于1 ng/μL时,不能够得到扩增产物;MDA处理组各浓度抑制物均能成功扩增,完全不受抑制物影响。结论 MDA技术可消除血红素及腐殖酸的抑制作用,其抗抑制能力优于磁珠法纯化DNA,具有一定的法医学应用意义。

关键词：法医遗传学核酸扩增技术多重置换扩增抑制物血红素腐殖酸

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多重置换扩增在病理切片DNA分型中的应用

法医学杂志 2013年第1期29卷 17-20页

作者：张越陈阳杨元立李继周李朝品皖南医学院医学三系安徽芜湖241002 公安部物证鉴定中心北京100038

目的探讨多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)技术应用于法医学组织病理切片DNA分型的可行性。方法采用重复拉丁方设计实验,按保存时间、组织类型、尸源年龄3个因素分7个水平进行随机分组,共制作98例病理切片。硅珠... 详细信息

目的探讨多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)技术应用于法医学组织病理切片DNA分型的可行性。方法采用重复拉丁方设计实验,按保存时间、组织类型、尸源年龄3个因素分7个水平进行随机分组,共制作98例病理切片。硅珠法制备DNA模板,对照组直接采用AmpFlSTR IdentifilerTM试剂盒进行PCR扩增,实验组进行MDA后再进行扩增。以新鲜尸体组织的分型结果为标准,对比分析切片实验组与对照组的基因座检出数与检出率。结果各保存时间切片实验组与对照组的基因座检出率相比差异有统计学意义(P0.01)。结论 MDA可提高病理切片模板基因组量,相对降低PCR扩增抑制物浓度,减少等位基因脱扣现象,有效提高基因座检出率,MDA在法医切片DNA分型中具有运用价值,但应注意切片保存时间与组织类型等因素对分型结果的影响。

关键词：法医遗传学冷冻切片多重置换扩增

基于多重置换扩增技术的RNA病毒基因组扩增方法研究

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病毒学报 2013年第4期29卷 432-436页

作者：庞正李建东李川梁米芳李德新中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒性出血热室北京102206

为了便于新发或罕见病毒性传染病的筛查检测,本研究利用多重置换扩增技术,以负链RNA病毒—发热伴血小板减少综合征病毒和正链RNA病毒—登革病毒为模拟样本探索临床样本中RNA病毒基因组非特异性扩增方法。研究中通过梯度稀释的RNA病毒模... 详细信息

为了便于新发或罕见病毒性传染病的筛查检测,本研究利用多重置换扩增技术,以负链RNA病毒—发热伴血小板减少综合征病毒和正链RNA病毒—登革病毒为模拟样本探索临床样本中RNA病毒基因组非特异性扩增方法。研究中通过梯度稀释的RNA病毒模拟样本中可能存在的不同丰度的病原体,样本核酸依次加工成单链cDNA、双链cDNA、T4DNA连接酶处理后的双链cDNA以及添加外源辅助RNA后合成并连接的双链cDNA形式,然后进行Phi29DNA聚合酶等温扩增,使用荧光定量PCR方法比较各种方法对RNA病毒核酸扩增的影响。结果显示,对于不同类型的RNA病毒模拟标本,多重置换扩增对于单链及双链cDNA的扩增效果有限,而双链cDNA经DNA连接酶处理后的扩增能达到6×103倍;在cDNA合成过程中加入外源辅助RNA,模拟样本中病毒基因组的扩增可达2×105倍,尤其是对含有低丰度病原体的模拟样本扩增效果的改善更为明显。本研究摸索建立了基于多重置换扩增技术的RNA病毒基因组扩增方法,能够对样本中低丰度RNA病毒基因组实现有效扩增,可满足开展多种病原体筛查检测的需求。

关键词：多重置换扩增 Phi29DNA聚合酶 RNA病毒

基于多重置换扩增及测序技术的胚胎植入前HLA分型方法

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中华医学遗传学杂志 2015年第6期32卷 771-775页

作者：张印峰罗海宁张云山天津市中心妇产科医院生殖医学中心 300053

目的建立基于多重置换扩增及测序技术的胚胎植入前HLA分型方法。方法随机选取9对自愿捐献外周血和废弃胚胎的夫妇，取D3废弃的1PN、2PN、3PN受精胚胎，取单个或两个卵裂球细胞，采用多重置换扩增（multiple displacement amplification... 详细信息

目的建立基于多重置换扩增及测序技术的胚胎植入前HLA分型方法。方法随机选取9对自愿捐献外周血和废弃胚胎的夫妇，取D3废弃的1PN、2PN、3PN受精胚胎，取单个或两个卵裂球细胞，采用多重置换扩增（multiple displacement amplification，MDA）进行全基因组扩增，对单个或两个卵裂球的MDA产物采用PCR扩增HLA—DR、DQ第2外显子，然后对扩增产物进行直接双向测序分型（sequencing based typing，SBT），确定胚胎HLA基因型；提取其父母外周血基因组DNA，采用同样的方法确定其HLA基因型；然后比较父母与胚胎之间HLA基因型，确定9个家庭成员各自的HLA单倍型及其遗传关系，并在废弃胚胎之间进行HLA配型。结果76个废弃胚胎被分为两组：单卵裂球组36个胚胎，两个卵裂球组40个胚胎。单卵裂球组扩增成功率为94．1％；两个卵裂球组扩增成功率为100％。共有74个胚胎MDA扩增成功。其产物行PCR—SBT检测，阳性率为100％。单卵裂球组MDA产物测序阳性率为100％，DQ等位基因脱扣率为1．5％，DR等位基因脱扣率为0。两个卵裂球组MDA产物测序阳性率为100％，DQ、DR等位基因脱扣率均为0。胚胎HLA单倍体重新组合率为20．2％（30／148）。废弃胚胎之间HLA配型一致的比例为20．3％（15／74）。比理论值25％略低，可能与本实验使用分级差、异常受精胚胎有关。结论植入前遗传学诊断／HLA分型方法MDA-PCR-SBT为选择与患儿HLA基因型一致且正常的纯合子（不携带致病基因）或者杂合子（携带隐性致病基因）胚胎移植，创造一个救助者同胞，分娩时使用救助者同胞的脐血或者骨髓移植用于治疗现存患儿提供了新的检测方法。

关键词：植入前遗传学诊断多重置换扩增骨髓移植 HLA基因型等位基因脱扣

少量细胞模板下多重置换扩增技术的保真度评估

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中华医学遗传学杂志 2010年第1期27卷 42-46页

作者：凌家炜方丛徐艳文庄广伦曹宝强中山大学附属第一医院生殖中心广州510080 The Institute for Computational Engineering and Sciences the University of Texas at Austin TX 78712 USA

目的应用单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）芯片，检测以少量细胞（1～10个）为模板的多重置换扩增（multiple displacement amplification，MDA）产物的保真度。方法结合10K2．0SNP芯片平台与MDA，以纤维母细胞系... 详细信息

目的应用单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）芯片，检测以少量细胞（1～10个）为模板的多重置换扩增（multiple displacement amplification，MDA）产物的保真度。方法结合10K2．0SNP芯片平台与MDA，以纤维母细胞系GM02732（47，XY，＋18）作为模板，共分6组进行实验，其中A组与B组分别为阳性对照组（细胞gDNA）与阴性对照组（无模板MDA）；C-F组为实验组，分别以1、2、5和10个细胞为模板进行MDA扩增，产物与芯片杂交，检测并比较各组产物的基因组覆盖率、等位基因杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）率以及等位基因脱扣（allele dropout，ADO）率。结果阴性对照组的MDA产物与gDNA序列有3．2％的重叠。随着起始模板从单细胞提升至10细胞，MDA产物的基因组覆盖率从86．4％逐步上升至96．4％，平均LOH率和ADO率则逐渐下降，各组之间比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论多重置换扩增技术是一种高效而可靠的全基因组扩增方法，随着模板细胞的增加，MDA产物的保真度可获得明显的改善。10K 2．0SNP芯片可快速准确地在全基因组水平对DNA扩增产物进行保真度分析，但应注意区分LOH中的ADO和等位基因优势扩增，以避免产生误差。

关键词：单核苷酸多态性单细胞多重置换扩增微阵列芯片保真度

多重置换扩增（MDA）结合多重PCR-Y染色体微缺失检测方法的探究

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多重置换扩增（MDA）结合多重PCR-Y染色体微缺失检测方法的探究

作者：卓胜楠天津医科大学

学位级别：硕士

目的：第一部分：通过对男性原发不育患者Y染色体微缺失的分析研究,探讨Y染色体微缺失的临床意义,为临床进行男性不育的诊断、治疗以及辅助生殖技术提供相应的理论依据。第二部分：回顾性分析Y染色体微缺失患者行ICSI-ET治疗的胚胎受精... 详细信息

目的：第一部分：通过对男性原发不育患者Y染色体微缺失的分析研究,探讨Y染色体微缺失的临床意义,为临床进行男性不育的诊断、治疗以及辅助生殖技术提供相应的理论依据。第二部分：回顾性分析Y染色体微缺失患者行ICSI-ET治疗的胚胎受精率、卵裂率、优胚率、妊娠率及早期流产率等指标,初步探讨Y染色体微缺失是否影响ICSI治疗结局。第三部分：通过多重置换扩增(MDA)联合聚合酶链式反应(PCR)建立单细胞AZF检测方法,为临床Y染色体微缺失患者植入前胚胎行AZF检测提供新的方法,为患者合理选择移植胚胎和更确切的遗传学咨询提供依据。方法：第一部分：以2012年1月～2012年10月于天津市中心妇产科医院生殖中心就诊的男性原发无精子症、严重少弱精子症和少精子症患者122例为研究对象。所有患者均按照世界卫生组织(WHO)推荐的方法和诊断标准加以确诊,排除内分泌失调及输精管阻塞等因素。留取上述患者外周血2mL,乙二胺四乙酸盐(EDTA)抗凝,标本在检测前置-20℃冰箱保存。选取30例已正常生育的健康男性为对照。采用盐析法提取DNA,选取15个位点进行Y染色体微缺失检测,包括AZFa区的sY82、sY84、sY86,AZFb区的sY124、sY127、sY128、sY133、sY134、sY143,AZFc区的sY239、sY242、sY254、sY255,AZFd区的sY145、sY152。将这15个位点组成4套多重PCR系统,分别为系统Ⅰ：SRY、sY254、sY143、sY242、sY255,系统Ⅱ：SRY、sY84、sY239、sY152,系统Ⅲ：SRY、sY86、sY127、sY145、sY124,系统Ⅳ：SRY、sY134、sY82、sY128、sY133。每套系统中以SRY基因作为内对照,同时以空白和己正常生育的男性作外对照。第二部分：回顾性分析5例Y染色体微缺失患者的6个ICSI周期和同期治疗的无Y染色体微缺失的严重少弱精子症或无精子症患者的胚胎情况,共57例62个ICSI周期,所有患者精液分析均按WHO标准,连续2次精液分析并经离心沉淀均无精子者为无精子症,精子浓度扩增,扩增成功的单淋巴细胞行性别鉴定(采用DYZ1/DXZ1引物,引物序列如下：DYZ1:5’-TCCACTTTATTCCAGGCCTGTCC-3’,5’-TTGAATGGAATGGGAACG AATGG-3’DXZ1:5’-AATGTGCAAGTGGCTATTTAGCG-3’5’-TCCATCATAAGG AATGTTCAGCT-3’),最后行AZF微缺失检测。比较外周血DNAAZF检测结果和单/两个淋巴细胞MDA扩增后的AZF检测结果,检验单细胞MDA-PCR-AZF检测方法的可行性和准确性。结果：第一部分：本研究收集男性不育患者122例,检出AZF基因微缺失患者共12例,总缺失率为9.8%(12/122),其中无精子症组、严重少弱精子症组和少精子症组患者的缺失率分别是11.1%(5/45)、10.9%(6/55)、4.5%(1/22);对照组30例正常男性均未发现AZF基因微缺失。12例AZF微缺失患者中,9例AZFc缺失,8例AZFd缺失,3例AZFa缺失。AZF缺失类型有3种,其中AZFc+d缺失8例,AZFa缺失3例,AZFc缺失1例。无精子症组和严重少弱精子症组患者Y染色体微缺失率明显高于少精子症组,差异有统计学意义(p0.05)。提示Y染色体微缺失对ICSI治疗结局可能有一定影响,但需大样本研究进一步证实。第三部分：(1)MDA扩增结果：本研究中86例男性单淋巴细胞MDA扩增成功率为98.8%(85/86),30例女性淋巴细胞MDA扩增均成功,成功率为100%。(2)性别鉴定结果：MDA扩增成功的淋巴细胞行性别鉴定,性别均与其血来源相符,阴性对照和空白对照均未见阳性结果。可以认为性别鉴定引物选择合适,性别鉴定成功率为100%。(3)AZF检测结果：86例男性不育患者外周血DNA中共检出9例Y染色体微缺失,缺失率为10.5

关键词：植入前遗传学诊断多重置换扩增 Y染色体微缺失性别鉴定