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西尼罗病毒多表位基因的融合表达及其免疫保护作用研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2007年第11期27卷 1037-1040页

作者：刘志国朱晓光杨保安刘伯华祝庆余军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的研究西尼罗病毒（WNV）多表位基因的融合表达及其免疫保护作用。方法利用生物信息软件Biosun分析西尼罗全基因序列，确定表位基因片段并选择合适片段连接构成多表位基因。采用重叠PCR方法扩增该基因，构建多表位基因的原核重组表达... 详细信息

目的研究西尼罗病毒（WNV）多表位基因的融合表达及其免疫保护作用。方法利用生物信息软件Biosun分析西尼罗全基因序列，确定表位基因片段并选择合适片段连接构成多表位基因。采用重叠PCR方法扩增该基因，构建多表位基因的原核重组表达载体pET-43a-M，进行融合表达和纯化。将表达蛋白加弗氏佐剂免疫小鼠并进行攻毒试验，观察其保护作用。结果分子克隆和构建了原核重组表达质粒pET-43a-M，表达和纯化了融合蛋白Nus-M，该蛋白免疫后的小鼠能够部分抵御西尼罗病毒的攻击。结论构建的西尼罗病毒多表位基因能够在原核细胞内表达，表达产物有较弱的免疫保护反应，为该病毒多表位抗原的串联及多表位疫苗研究提供了试验资料，但需要进一步改进。

关键词：西尼罗病毒多表位基因免疫保护

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弓形虫多表位基因植物表达载体的构建

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2003年第2期21卷 106-109页

作者：周晓红陈晓光张晓东杨培梁习佳飞胡建军王亚楠李林沈树满第一军医大学寄生虫学教研室广州510515 北京市农林科学院生物技术研究中心北京100089 第一军医大学学员一旅五队广州510515

目的构建弓形虫多表位基因(TGMG)植物表达载体。方法①将TGMG亚克隆人pBAC55构建中间载体pB35MG,再将其中E35S/TGMG/NOS3′结构单元亚克隆人pCAMBIA2300构建植物表达载体pC35MG。②将番茄果实特异性启动子E81.1插入pB35MG构建中间载体p... 详细信息

目的构建弓形虫多表位基因(TGMG)植物表达载体。方法①将TGMG亚克隆人pBAC55构建中间载体pB35MG,再将其中E35S/TGMG/NOS3′结构单元亚克隆人pCAMBIA2300构建植物表达载体pC35MG。②将番茄果实特异性启动子E81.1插入pB35MG构建中间载体pB35E1MG,再将其中E35SE81.1/TGMG/NOS3′结构单元亚克隆人pCAMBIA2300构建植物表达载体pC35E1MG。③将番茄果实特异性启动子E82.2插入pB35MG构建中间载体pBE2MG,再将其中E82.2/TGMG/NOS3′结构单元亚克隆人pCAMBIA2300构建植物表达载体pCE2MG。测序鉴定pB35MG、pC35E1MG、pCE2MG中的TGMG序列。④pC35MG、pC35E1MG、pCE2MG转化根癌农杆菌LBA404。结果重组质粒用酶切鉴定均得到预期片段,pB35MG、pC35E1MG、pCE2MG测序结果正确。结论成功构建TGMG中间载体pB35MG、pB35E1MG、pBE2MG,以及植物表达载体pC35MG、pC35E1MG、pCE2MG。并将3种植物表达载体导入根癌农杆菌。

关键词：弓形虫多表位基因植物表达载体番茄果实特异性启动子

丙型肝炎病毒多表位基因核酸疫苗的构建及其免疫原性

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中国生物制品学杂志 2007年第9期20卷 633-636页

作者：韦三华尹文雷迎峰胡兴斌董轲李斌张青张惠中第四军医大学唐都医院临床实验与检验输血科西安710038 第四军医大学基础部微生物学教研室西安710032

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）-CtEm,用该重组质粒免疫BALB/c小鼠,并检测其免疫原性.方法用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切含有HCV C区、E2区模拟表位和NS3～NS5区细胞表位串联基因的原核表达载体pQE30-C... 详细信息

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）-CtEm,用该重组质粒免疫BALB/c小鼠,并检测其免疫原性.方法用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切含有HCV C区、E2区模拟表位和NS3～NS5区细胞表位串联基因的原核表达载体pQE30-CtEm,克隆入真核表达载体pcDNA3.1（-）,脂质体瞬时转染CHO细胞,并检测其表达.以100 μg重组质粒免疫BALB/c小鼠,检测其体液免疫和细胞免疫效果.结果所构建的真核表达载体pcDNA3.1（-）-CtEm在CHO细胞中能获得有效表达.该质粒免疫小鼠后可诱导高水平的抗体,特异性淋巴细胞增殖反应、IFN-γ水平及CTL活性均明显高于空载体和生理盐水对照组.结论已成功构建HCV多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）-CtEm,免疫小鼠后可诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答.

关键词：丙型肝炎病毒多表位基因核酸疫苗免疫原性

弓形虫多表位基因的构建及其在大肠杆菌系统中的表达鉴定

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中国人兽共患病杂志 2002年第2期18卷 37-40,16页

作者：杨培梁陈晓光第一军医大学南方医院实验动物研究所广州510515 第一军医大学寄生虫学教研室广州510515

目的　构建弓形虫和破伤风毒素多个表位的编码基因 ,将其在大肠杆菌系统进行表达 ,评价重组抗原的特异反应性。方法　从弓形虫保护性抗原及通用免疫增强佐剂破伤风毒素中选取含有T和 (或 )B细胞表位的抗原片段 ,通过软件分析在各片段之... 详细信息

目的　构建弓形虫和破伤风毒素多个表位的编码基因 ,将其在大肠杆菌系统进行表达 ,评价重组抗原的特异反应性。方法　从弓形虫保护性抗原及通用免疫增强佐剂破伤风毒素中选取含有T和 (或 )B细胞表位的抗原片段 ,通过软件分析在各片段之间插入适当数目、起间隔作用的氨基酸 ,以保持个片段的空间构象独立性 ,从而确定氨基酸顺序。根据氨基酸序列选取适当的密码子构成弓形虫多表位基因。将该基因合成并鉴定后 ,亚克隆入原核表达载体 ,在大肠杆菌中表达并分析表达产物的表达形式和抗原活性。结果　成功构建了长度为 36 0bp的弓形虫多表位基因。该基因在原核表达系统中经诱导 ,得到了 14 4kDa的包涵体形式的表达产物。免疫印迹实验表明该产物具有强特异性抗原活性。

关键词：弓形虫多表位基因大肠杆菌蛋白表达抗原活性

HSV-2gD、HBsAg和IL18多表位基因疫苗的构建方法

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免疫学杂志 2012年第4期28卷 337-340页

作者：焦凤萍郑绮菡王玉于爱莲于广福泰山医学院病原学教研室泰安271000

目的研究多表位串联重组核酸疫苗中IL18与HBsAg(S)抗原、P6(NP6)抗原在质粒中所处位置的差异对抗原表达是否有影响。方法分别将IL18连接在融合蛋白P6-S(NP6-S)的氨基端和羧基端,即构建4种质粒:pc-IL18-P6-S、pc-IL18-NP6-S、pc-S-P6-IL1... 详细信息

目的研究多表位串联重组核酸疫苗中IL18与HBsAg(S)抗原、P6(NP6)抗原在质粒中所处位置的差异对抗原表达是否有影响。方法分别将IL18连接在融合蛋白P6-S(NP6-S)的氨基端和羧基端,即构建4种质粒:pc-IL18-P6-S、pc-IL18-NP6-S、pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL18。采用DNAstar软件分析4种质粒表达的融合蛋白的抗原性。将重组质粒分别转染CHO细胞进行瞬时表达,通过间接免疫荧光和Western blotting检测S、P6(NP6)抗原的表达情况,以确定最佳的连接方式。结果应用DNAstar软件分析可知IL18在融合蛋白的氨基端的抗原性高于在羧基端。间接免疫荧光检测结果发现IL18位于融合蛋白羧基端的质粒表达的抗原性优于氨基端,即:质粒pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL18的S、P6(NP6)抗原的表达情况均优于质粒pc-IL18-P6-S和pc-IL18-NP6-S,故选用质粒pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL18作为优势质粒。结论成功构建了4种质粒,并确定了优势质粒,此项技术将为新一代多基因核酸疫苗的研制提供实验依据,从而为构建更加有效的多价DNA疫苗奠定了良好的基础。

关键词：多表位基因 IL-18 单纯疱疹病毒II型 HBsAg DNA疫苗

Asia1型口蹄疫病毒多表位基因的原核表达及ELISA检测方法的建立

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中国兽医科学 2009年第1期39卷 45-49页

作者：鲁会军金宁一郑敏韩松霍晓伟田明尧李霄金扩世中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130062 吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062

根据国内流行的Asia 1型口蹄疫病毒的基因组特性,合成了Asia 1型口蹄疫病毒2个流行毒株VP1基因的5个抗原表位,并将其克隆到pMD18-T载体上,再按设计的酶切位点连接,构建出Asia 1型口蹄疫病毒VP1双拷贝基因片段(VP1 Asia)。然后,将VP1 Asi... 详细信息

根据国内流行的Asia 1型口蹄疫病毒的基因组特性,合成了Asia 1型口蹄疫病毒2个流行毒株VP1基因的5个抗原表位,并将其克隆到pMD18-T载体上,再按设计的酶切位点连接,构建出Asia 1型口蹄疫病毒VP1双拷贝基因片段(VP1 Asia)。然后,将VP1 Asia基因连接到原核表达载体pET-28a(+)上,构建了重组表达质粒pET-28a-VP1 Asia,接着将其转入BL21菌中进行原核表达。以纯化的表达蛋白作为抗原检测了牛Asia 1型口蹄疫病毒阳性血清。结果显示,VP1 Asia基因在大肠杆菌中获得了高效表达,以纯化的VP1Asia蛋白作为抗原建立了检测Asia 1型口蹄疫病毒抗体的ELISA方法。以建立的ELISA方法和标准Asia 1型口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒对30份临床样品进行了检测,两种检测方法的阳性率分别为90.0%(27/30)和93.3%(28/30),符合率为89.7%(26/29)。本研究为组装Asia 1型口蹄疫病毒抗体ELISA诊断试剂盒奠定了基础。

关键词：口蹄疫亚洲1型多表位基因酶联免疫吸附试验

Asia1型口蹄疫病毒多表位基因的设计及其在毕赤酵母中的表达

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中国兽医科学 2009年第1期39卷 11-15页

作者：鲁会军金宁一郑敏韩松霍晓伟胡博田明尧金扩世中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130062 内蒙古民族大学动物科技学院内蒙古通辽028000 吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062

为制备Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)特异性诊断抗原,根据国内Asia 1型FMDV流行毒株的序列,合成了2个FMDV流行毒株VP1基因的5个抗原表位。采用InsightⅡ软件进行蛋白空间构象模拟,证实设计的多表位分子结构符合要求。将合成的多表位基因按... 详细信息

为制备Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)特异性诊断抗原,根据国内Asia 1型FMDV流行毒株的序列,合成了2个FMDV流行毒株VP1基因的5个抗原表位。采用InsightⅡ软件进行蛋白空间构象模拟,证实设计的多表位分子结构符合要求。将合成的多表位基因按设计的酶切位点进行酶切连接,构建了Asia 1型FMDV VP1双拷贝基因重组质粒(pMD18-dVP1 Asia)。从该重组质粒获得dVP1 Asia基因,与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建了重组表达质粒pPIC9K-dVP1 Asia。用BglⅡ将重组表达质粒线性化后,转化GS115酵母菌。经筛选、鉴定,成功获得了表达FMDV多表位VP1蛋白的阳性重组酵母菌。该阳性重组酵母菌经甲醇诱导,在培养液上清中可检测到目的蛋白。Western-blot结果显示,该蛋白能特异识别Asia 1型FMDV抗体,且具有很好的反应原性。

关键词： Asia1型口蹄疫病毒多表位基因分子设计毕赤酵母表达

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西尼罗病毒多表位基因免疫保护研究

中国人兽共患病学报 2008年第4期24卷 285-289页

作者：刘志国朱晓光刘伯华祝庆余军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的探讨西尼罗病毒多表位基因诱导体液及细胞免疫的可行性及其免疫攻毒保护作用。方法将西尼罗病毒多抗原表位基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-M。通过脂质体转染法将该多表位基因导入BHK细胞中,采用RT... 详细信息

目的探讨西尼罗病毒多表位基因诱导体液及细胞免疫的可行性及其免疫攻毒保护作用。方法将西尼罗病毒多抗原表位基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-M。通过脂质体转染法将该多表位基因导入BHK细胞中,采用RT-PCR和IFA检测其在细胞内的瞬时表达。将重组质粒通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过间接免疫ELISA法、CTL杀伤功能检测和淋巴细胞增殖试验等,检测小鼠体内特异性体液免疫和细胞免疫的水平。在此基础上进行攻毒试验,分析重组质粒DNA对西尼罗病毒攻击的免疫保护作用。结果重组质粒pcDNA3.1-M能够在真核细胞内表达,采用IFA方法能在细胞内检测到西尼罗病毒特异性抗原。在抗原的刺激下,免疫后的小鼠脾淋巴细胞增殖显著,可诱导特异性CTL应答反应。攻毒试验显示,重组多表位基因能够对西尼罗病毒的攻击起到一定的保护作用,达到50%,中和抗体效价达到1∶50,应用免疫佐剂或应用重组蛋白加强免疫后,其保护率为62.5%,中和抗体效价达到1∶90。结论西尼罗病毒多表位基因可诱发特异性免疫应答,对西尼罗病毒感染具有保护作用,为其基因疫苗研制提供了一定的实验依据。

关键词：西尼罗病毒多表位基因 DNA免疫免疫保护

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丙型肝炎病毒多表位基因载体的构建与表达

中国病原生物学杂志 2015年第4期10卷 293-298页

作者：邝玉孙梦雯杨远马巨辉李明远四川大学基础医学与法医学院微生物学教研室四川成都610041

目的构建编码多个丙型肝炎病毒(HCV)抗原表位的真核表达载体,建立稳定转染的细胞株,并利用小鼠移植瘤模型初步评估疫苗在动物体内的免疫反应状况。方法合成含10条CTL细胞表位的M2基因,与含多条B细胞及T细胞表位的M1基因连接合成M1M2基因... 详细信息

目的构建编码多个丙型肝炎病毒(HCV)抗原表位的真核表达载体,建立稳定转染的细胞株,并利用小鼠移植瘤模型初步评估疫苗在动物体内的免疫反应状况。方法合成含10条CTL细胞表位的M2基因,与含多条B细胞及T细胞表位的M1基因连接合成M1M2基因;将M2、M1M2基因分别与pcDNA3.1(+)连接,构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/M2及pcDNA3.1(+)/M1M2;将上述两种载体与pcDNA3.1(+)/M1分别转入SP2/0细胞中,并检测目的蛋白表达;用3种重组质粒分别免疫BALB/c小鼠移植瘤模型,初步评估疫苗引起的免疫反应。结果 3种真核表达载体在SP2/0细胞中均能得到稳定表达,免疫荷瘤小鼠后,小鼠瘤体的大小M1M2组多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/M1M2,用该表达载体免疫小鼠可引起较强的特异性免疫应答。

关键词：丙型肝炎病毒多表位基因核酸疫苗