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转氨酶固定化及其连续流催化合成尼拉帕利手性中间体的研究

转氨酶固定化及其连续流催化合成尼拉帕利手性中间体的研究

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作者：张加强西南交通大学

学位级别：硕士

尼拉帕利是一种口服的聚腺苷二磷酸(ADP)核糖聚合酶(PAPR)抑制剂,主要用于晚期复发性卵巢癌的维持治疗,可显著延长晚期卵巢癌病人的生存期,减少卵巢癌的复发。尼拉帕利的合成最重要的是构建高手性纯度的中间体(S)-5-(4-溴苯基)哌啶-2-酮... 详细信息

尼拉帕利是一种口服的聚腺苷二磷酸(ADP)核糖聚合酶(PAPR)抑制剂,主要用于晚期复发性卵巢癌的维持治疗,可显著延长晚期卵巢癌病人的生存期,减少卵巢癌的复发。尼拉帕利的合成最重要的是构建高手性纯度的中间体(S)-5-(4-溴苯基)哌啶-2-酮,但目前化学方法合成存在许多缺点,如收率低、选择性差以及反应成本高等。因此,本课题通过对实验室内构建并保藏的四种ω-转氨酶进行预筛选,获得高活力及高对映体选择性的S型ω-转氨酶ATA-301,该酶能够高效催化合成尼拉帕利中间体。在此基础上,以一种多点共价固定化方式将其固定于环氧树脂载体上,并对固定化条件和固定化酶催化条件进行单因素优化,最终获得的固定化酶比酶活为72.11 U/g,酶活回收率达到53.38%。最后,将固定化酶ATA301@ES103B应用于连续流反应系统,成功催化合成尼拉帕利手性中间体。本文主要研究内容如下:(1)尼拉帕利前体酮的制备。以琥珀酸酐为起始原料,通过Friedel-Crafts酰化反应,DCC缩合反应,Corey-Chaykovsky环氧化反应和环氧乙烷重排反应合成尼拉帕利前体酮4-(4-溴苯基)-5-氧代丁酸异丙酯。按照文献的描述,以浓硫酸为催化剂,酯化产物实际收率仅为37%,本实验采用DMAP为催化剂,DCC为缩合剂进行反应,产物收率明显提高,达到98.8%。同时,实验操作中发现以KOt-Bu为强碱对三甲基碘化亚砜脱质子得到二甲基亚砜亚甲基叶立德的效果并不好,环氧化反应失败,而采用碱性更强的Na H后,产物收率达到80%。(2)转氨酶的筛选。以上述制备的尼拉帕利前体酮为底物,吡哆醛-5-磷酸酯(PLP)为辅助因子,i-Pr NH为胺供体,对实验室内构建并保藏的四种转氨酶进行筛选。最后获得了高活力及高对映体选择性的S型ω-转氨酶ATA-301,目标产物尼拉帕利手性中间体的收率为87%,ee值为99%以上。(3)固定化条件的优化及固定化酶性质的研究。以蛋白吸附率和酶活回收率为指标对6种不同的树脂载体进行筛选,确定最佳固定化载体为环氧基树脂ES-103B。通过对转氨酶ATA-301固定于环氧基树脂载体ES-103B上的固定化工艺条件进行优化,最终确定最佳固定化工艺条件为:载体和转氨酶以质量比10∶1,固定化时间8 h,磷酸盐缓冲液500 mmol/L p H 7.0,温度30℃。优化了固定化酶ATA301@ES103B催化合成尼拉帕利手性中间体的反应条件,结果表明在100 mmol/L p H 9.0磷酸盐缓冲液中,温度为50℃时固定化酶活达到最高。对固定化酶的储存稳定性和重复批次操作稳定性进行考察,发现在4℃冰箱保存15天后还保有89.83%的残余酶活,在重复使用10次后仍保持初始酶活的80.41%,展现出良好的储存稳定性和操作稳定性。(4)运用连续流法制备尼拉帕利手性中间体及其工艺优化。将上述所得固定化酶ATA301@ES103B填充于反应柱(内径5 mm,长度10 cm)中,对连续流工艺条件进行了优化,筛选出最优工艺条件:2.0 g固定化酶填料量,反应液流速为0.3 m L/min,反应液流向为从反应柱上口泵至下口。在该条件下进行尼拉帕利手性中间体的连续不对称合成,时空产率可达968.2 g/(L·d),在连续流动24 h后催化反应的转化率都在90%以上,表明在该连续流反应系统中进行(S)-5-(4-溴苯基)哌啶-2-酮的高效、连续生产具有非常高的可行性。

关键词：尼拉帕利尼拉帕利前体酮 ω-转氨酶环氧基树脂多点共价固定化连续流反应

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卤醇脱卤酶的固定化及其在合成环氧氯丙烷中的应用

卤醇脱卤酶的固定化及其在合成环氧氯丙烷中的应用

引用

作者：顾恺浙江工业大学

学位级别：硕士

环氧氯丙烷(ECH)是一种重要的有机化工和精细化工原料,其中具有光学活性的环氧氯丙烷也是一种重要的的C手性药物合成中间体,在医药、农药和精细化工等领域有极为广泛的应用。目前生物柴油副产物甘油的大量增加,甘油价格大幅度降低,将甘... 详细信息

环氧氯丙烷(ECH)是一种重要的有机化工和精细化工原料,其中具有光学活性的环氧氯丙烷也是一种重要的的C手性药物合成中间体,在医药、农药和精细化工等领域有极为广泛的应用。目前生物柴油副产物甘油的大量增加,甘油价格大幅度降低,将甘油转化为手性ECH工艺已成为甘油高值化利用的重要方向之一。卤醇脱卤酶是化学-酶法转化甘油合成手性ECH的关键酶。为进一步提高卤醇脱卤酶的操作稳定性和重复使用性、减少催化剂生产成本、提高产物回收率,本论文采用多点共价固定化法对卤醇脱卤酶进行了固定化,对固定化工艺参数进行优化,研究了固定化酶的酶学性质及其在填充床式反应器中的应用,主要研究结果如下:首先,对卤醇脱卤酶的固定化制备进行了研究。对不同树脂载体进行了筛选,确定最佳固定化载体为ES-103B环氧树脂。其最佳固定化工艺为:在25℃下,吸附缓冲液为0.1 M,pH 7.0磷酸钠缓冲液,加入酶液使其浓度为0.5 mg/mL,25℃固定10 h。取出固定化酶重新置于共价缓冲液(0.1 M,pH 9.0磷酸钠缓冲液)中,30℃保温24 h。在优化条件下,酶活回收率为72.4%,固定化效率为94.5%,固定化酶比酶活可达528 U/g。其次,对固定化卤醇脱卤酶的酶学性质进行了表征。结果表明,固定化酶最适反应温度为70℃,最适pH为9.0。在40℃,50℃,60℃温度下的半衰期分别为68.6 day、25.8 day、1.3 day。在pH 8.0-10.0保温7天后仍保留90%左右的酶活。在4℃贮藏30天仍保留85%以上的酶活。在底物浓度40 mM下,催化过程的最佳固定化酶量为40 g/L以及催化反应所需的时间为40 min。其在反应釜反应器中的操作稳定性,经过15批反应后还有相对初始95%左右的收率。最后,对固定化卤醇脱卤酶在填充床反应器中催化过程进行了研究。确定了最优的反应条件为:填充床高径比(H/D)为2.7,固定化卤醇脱卤酶填充量为60 g/L,底物流速为8 mL/min,反应温度为40℃,反应时间为40 min。连续反应50批后产物收率仍保持相对第一批收率的90%以上。为了减少产物对酶的抑制作用,在填充床反应装置中耦联HZD-9大孔树脂吸附柱,通过催化产物的原位吸附,产物ECH的时空产率从4.20g/L/h提高到7.38 g/L/h。对固定化卤醇脱卤酶突变体(P175S/W249P)立体选择性催化1,3-DCP生成(S)-ECH条件进行了研究。确定固定化酶最适反应温度为65℃,最适pH为9.0。考察了在催化过程中控制反应pH对催化效果的影响,当反应pH在8.5-9.0时,底物浓度从40 mM提高到80 mM。考察了固定化酶在反应釜反应器中的操作稳定性表明,反应25批次后,(S)-ECH的收率相比初始收率仍有80%以上。

关键词：卤醇脱卤酶环氧氯丙烷 1,3-二氯-2-丙醇多点共价固定化填充床反应器

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转氨酶固定化及在西他列汀中间体合成中应用

转氨酶固定化及在西他列汀中间体合成中应用

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作者：董正伟浙江工业大学

学位级别：硕士

西他列汀作为Januvia的主要成分,已经成为糖尿病治疗领域的有效药物。经过默克公司对西他列汀合成方法的不断改进,第三代生物酶法,即利用固定化转氨酶,以西他列汀前体酮作为底物,不对称合成西他列汀,并成功实现产业化。然而该工艺有机... 详细信息

西他列汀作为Januvia的主要成分,已经成为糖尿病治疗领域的有效药物。经过默克公司对西他列汀合成方法的不断改进,第三代生物酶法,即利用固定化转氨酶,以西他列汀前体酮作为底物,不对称合成西他列汀,并成功实现产业化。然而该工艺有机溶剂使用量大,存在较大的安全隐患及环境问题。本文以一种多点共价固定化方法制备固定化转氨酶,用于催化合成西他列汀,对固定化工艺流程进行优化,对固定化酶学性质进行了考察,并对填充床式固定化酶反应器催化合成西他列汀工艺参数进行了研究。本文首先研究了重组转氨酶的固定化工艺。筛选了实验室现有环氧树脂载体,选择了国产聚甲基丙烯酸树脂ES-103b树脂作为固定化载体。文章确定了最佳固定化工艺:在25?C条件下,树脂载体与酶液（6 g/L）以质量体积比1:20混合,其中转氨酶冻干粉溶解于1 M磷酸钾缓冲液（p H 7.0,2 m M PLP）中形成固定化所需的酶液。将此固定化体系置于25?C水浴震荡孵育24 h,取出固定化酶重新置于100m M,p H9.0磷酸钾缓冲液中,30?C保温30 h。取出再置于3 M,p H8.5的甘氨酸缓冲液中,25?C保温12 h。最终固定化酶比酶活达到45.6 U/g。然后我们将固定化体系同比例放大至500 m L,最终得到的固定化酶活为52.7 U/g湿载体,酶活回收率达到49.3%。其次研究了固定化酶的酶学性质。固定化酶催化反应的最适温度为50?C,在40?C,50?C,60?C温度条件下的半衰期分别为33.1 day、20.2 day、8.3 day。该酶催化反应的最适p H并没有改变,且在中性及弱碱性条件下酶活比较稳定。但超过了9.0酶活迅速降低。固定化酶对于西他列汀前体酮至西他列汀催化反应具有很好的立体选择性,产物e.e.值在99.9%以上。本文优化了固定化酶催化合成西他列汀反应条件。分别考察了氨基供体种类及浓度,底物浓度,产物浓度,助溶剂种类对催化反应影响。文章选择异丙胺作为固定化酶最适氨基供体,当异丙胺浓度为50 m M时,固定化酶活达到最高。当选择DMSO作为固定化酶催化体系助溶剂时,4 h之内催化转化率即达到40%,催化效果明显好于其它助溶剂。而对于底物,当底物浓度30 g/L,固定化酶添加量为1 g时,20 h时底物转化率即超过50%,时空产率达到0.81 g/（L.h.g湿载体）。产物对固定化酶催化转氨反应抑制作用较为强烈,当产物浓度超过15 g/L时固定化酶催化反应终止并逆向进行。最后研究了固定化酶填充床式反应器在制备西他列汀时的反应条件。确定了最优的操作条件:反应液体积200 m L,底物浓度为30g/L,填充床高径比为11:1,固定化酶填充量为30 g,底物流速为2.6 m L/min。在此条件下,底物转化率达到50%时所需的时间约为15 h。固定化酶在10批后,转化率仍保持在45%以上,酶活没有明显损失,固定化酶稳定性良好。

关键词：西他列汀西他列汀前体酮西他列汀转氨酶多点共价固定化磷酸吡哆醛填充床式反应器

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