转氨酶固定化及其连续流催化合成尼拉帕利手性中间体的研究

作     者：张加强 

作者单位：西南交通大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陆群

授予年度：2021年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：尼拉帕利 尼拉帕利前体酮 ω-转氨酶 环氧基树脂 多点共价固定化 连续流反应 

摘      要：尼拉帕利是一种口服的聚腺苷二磷酸(ADP)核糖聚合酶(PAPR)抑制剂,主要用于晚期复发性卵巢癌的维持治疗,可显著延长晚期卵巢癌病人的生存期,减少卵巢癌的复发。尼拉帕利的合成最重要的是构建高手性纯度的中间体(S)-5-(4-溴苯基)哌啶-2-酮,但目前化学方法合成存在许多缺点,如收率低、选择性差以及反应成本高等。因此,本课题通过对实验室内构建并保藏的四种ω-转氨酶进行预筛选,获得高活力及高对映体选择性的S型ω-转氨酶ATA-301,该酶能够高效催化合成尼拉帕利中间体。在此基础上,以一种多点共价固定化方式将其固定于环氧树脂载体上,并对固定化条件和固定化酶催化条件进行单因素优化,最终获得的固定化酶比酶活为72.11 U/g,酶活回收率达到53.38%。最后,将固定化酶ATA301@ES103B应用于连续流反应系统,成功催化合成尼拉帕利手性中间体。本文主要研究内容如下:(1)尼拉帕利前体酮的制备。以琥珀酸酐为起始原料,通过Friedel-Crafts酰化反应,DCC缩合反应,Corey-Chaykovsky环氧化反应和环氧乙烷重排反应合成尼拉帕利前体酮4-(4-溴苯基)-5-氧代丁酸异丙酯。按照文献的描述,以浓硫酸为催化剂,酯化产物实际收率仅为37%,本实验采用DMAP为催化剂,DCC为缩合剂进行反应,产物收率明显提高,达到98.8%。同时,实验操作中发现以KOt-Bu为强碱对三甲基碘化亚砜脱质子得到二甲基亚砜亚甲基叶立德的效果并不好,环氧化反应失败,而采用碱性更强的Na H后,产物收率达到80%。(2)转氨酶的筛选。以上述制备的尼拉帕利前体酮为底物,吡哆醛-5-磷酸酯(PLP)为辅助因子,i-Pr NH为胺供体,对实验室内构建并保藏的四种转氨酶进行筛选。最后获得了高活力及高对映体选择性的S型ω-转氨酶ATA-301,目标产物尼拉帕利手性中间体的收率为87%,ee值为99%以上。(3)固定化条件的优化及固定化酶性质的研究。以蛋白吸附率和酶活回收率为指标对6种不同的树脂载体进行筛选,确定最佳固定化载体为环氧基树脂ES-103B。通过对转氨酶ATA-301固定于环氧基树脂载体ES-103B上的固定化工艺条件进行优化,最终确定最佳固定化工艺条件为:载体和转氨酶以质量比10∶1,固定化时间8 h,磷酸盐缓冲液500 mmol/L p H 7.0,温度30℃。优化了固定化酶ATA301@ES103B催化合成尼拉帕利手性中间体的反应条件,结果表明在100 mmol/L p H 9.0磷酸盐缓冲液中,温度为50℃时固定化酶活达到最高。对固定化酶的储存稳定性和重复批次操作稳定性进行考察,发现在4℃冰箱保存15天后还保有89.83%的残余酶活,在重复使用10次后仍保持初始酶活的80.41%,展现出良好的储存稳定性和操作稳定性。(4)运用连续流法制备尼拉帕利手性中间体及其工艺优化。将上述所得固定化酶ATA301@ES103B填充于反应柱(内径5 mm,长度10 cm)中,对连续流工艺条件进行了优化,筛选出最优工艺条件:2.0 g固定化酶填料量,反应液流速为0.3 m L/min,反应液流向为从反应柱上口泵至下口。在该条件下进行尼拉帕利手性中间体的连续不对称合成,时空产率可达968.2 g/(L·d),在连续流动24 h后催化反应的转化率都在90%以上,表明在该连续流反应系统中进行(S)-5-(4-溴苯基)哌啶-2-酮的高效、连续生产具有非常高的可行性。