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多杀性巴氏杆菌分子分型方法简述

微生物学报 2016年第10期56卷 1521-1529页

作者：彭忠梁婉吴斌华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室生猪健康养殖协同创新中心湖北武汉430070 华中农业大学动物科学技术学院农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室生猪健康养殖协同创新中心湖北武汉430070

多杀性巴氏杆菌是一种能感染多种动物甚至是人的重要革兰氏阴性病原菌。目前临床上用于多杀性巴氏杆菌诊断的分型方法主要包括血清学分型方法和分子分型方法。其中血清学分型方法主要基于免疫学实验技术建立,操作过程繁琐,技术要求高,... 详细信息

多杀性巴氏杆菌是一种能感染多种动物甚至是人的重要革兰氏阴性病原菌。目前临床上用于多杀性巴氏杆菌诊断的分型方法主要包括血清学分型方法和分子分型方法。其中血清学分型方法主要基于免疫学实验技术建立,操作过程繁琐,技术要求高,工作量大,不适用于临床上大规模快速开展多杀性巴氏杆菌流行病学调查的需要;而基于分子生物学手段建立的分子分型方法相对于传统的血清学分型方法而言具有快速、简单、灵敏、灵活等特点,特别是某些分子分型方法与传统的分型方法形成了较为精确的对应关系,因而在临床上得到了广泛的应用。目前适用于临床上开展多杀性巴氏杆菌分离鉴定的分子分型方法主要包括多重PCR方法及多位点序列分型法(MLST),其中多重PCR方法又包括基于荚膜编码区及脂多糖外核编码簇建立的PCR方法。本文将重点就这3种常用的多杀性巴氏杆菌分子分型方法进行综述,介绍其建立原理、实现手段以及各自的优缺点,为临床上开展多杀性巴氏杆菌的流行病学调查特别是分子流行病学调查提供参考。

关键词：多杀性巴氏杆菌分子分型方法多重PCR 多位点序列分型

多杀性巴氏杆菌荚膜的生物合成及其调控机制研究进展

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中国农业科学 2020年第3期53卷 658-668页

作者：关丽君薛云丁文文赵战勤河南科技大学动物科技学院兽医生物制品工程实验室河南科技大学动物科技学院/河南省高等学校环境与畜产品安全重点学科开放实验室

多杀性巴氏杆菌可广泛感染多种动物,引起出血性败血症或传染性肺炎。多杀性巴氏杆菌的细胞表面具有一层黏液样的荚膜多糖,是其重要的结构成分和毒力因子,在细菌与宿主的相互作用中起到重要作用,促进细菌粘附于宿主表面,增强细菌的毒力... 详细信息

多杀性巴氏杆菌可广泛感染多种动物,引起出血性败血症或传染性肺炎。多杀性巴氏杆菌的细胞表面具有一层黏液样的荚膜多糖,是其重要的结构成分和毒力因子,在细菌与宿主的相互作用中起到重要作用,促进细菌粘附于宿主表面,增强细菌的毒力。多杀性巴氏杆菌荚膜的分子结构与脊椎动物的糖胺聚糖(GAG)相似,都由重复的二糖单元聚合形成线性多糖链,这是该菌在感染宿主过程中进行分子伪装、抵抗吞噬和发生免疫逃逸的重要免疫学物质基础。近年来,在多杀性巴氏杆菌荚膜的生物合成及其调控机制方面取得了一系列重要的研究进展,为多杀性巴氏杆菌荚膜的分子致病机理研究提供了一定的基础知识,为多杀性巴氏杆菌荚膜多糖疫苗的研发提供了理论依据。文章系统阐述了多杀性巴氏杆菌荚膜的生物合成途径及其表达调控机制,主要包括荚膜的血清分型、荚膜多糖的成分与结构、荚膜的生物合成基因簇与功能、荚膜多糖的分子合成机制、荚膜生物合成基因簇的表达调控机制,共5个方面。依据荚膜抗原,多杀性巴氏杆菌可分为A、B、D、E、F共5种荚膜血清型。A型荚膜GAG成分是透明质酸、D型是肝素、F型是软骨素,分别由其相应的二糖单元[β-葡糖醛酸/β-乙酰葡糖胺]、[β-葡糖醛酸/α-乙酰葡糖胺]、[β-葡糖醛酸/β-乙酰半乳糖胺]重复构成;B型荚膜多糖是由阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖以某种结构形式聚合而成,E型荚膜多糖的成分与化学结构尚不确定。多杀性巴氏杆菌A型、B型、D型、E型和F型荚膜多糖生物合成的相关基因以基因簇的形式存在,分为3个不同的功能区,R1、R2和R3;R1区负责转运荚膜多糖,R2区负责单糖的活化和荚膜多糖的组装,R3区负责荚膜多糖的修饰(磷脂替换);根据R2区结构和基因数量的不同又可将5种荚膜的生物合成基因簇分为两类:A型、D型、F型为I类,R2区含有4个基因;B型和E型为II类,R2区含有9个基因,且利用R2区特异性基因设计引物,可以通过PCR方法快速鉴定多杀性巴氏杆菌的荚膜血清型。多杀性巴氏杆菌的荚膜GAG在细胞质中生成,由R1区编码蛋白所形成的ABC转运体输出至细胞表面,末端糖脂通过分子间氢键与细胞壁紧密结合,形成菌体表面的粘液状荚膜;在多杀性巴氏杆菌荚膜GAG的生物合成过程中,位于R2区的糖基转移酶基因决定了活化单糖的种类和组装后荚膜多糖的类型。在多杀性巴氏杆菌荚膜的生物合成基因簇中,R1和R2区形成一个操纵子,转录方向一致,而R3转录方向与其相反,两者的启动子区域均位于R2和R3区域之间的DNA序列上;多杀性巴氏杆菌荚膜生物合成基因簇的转录过程受Fis蛋白正向调控,翻译过程主要受Hfq蛋白正向调节。

关键词：多杀性巴氏杆菌荚膜糖胺聚糖生物合成表达调控

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多杀性巴氏杆菌攻毒小鼠肺脏的转录组分析

基因组学与应用生物学 2022年第4期41卷 778-788页

作者：陈杰陈巧玲陈思程逸文刘志勇李彬刘昂满初日嘎王凤阳杜丽李昌金宁一海南大学动物科技学院海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室海口570228 军事医学科学院军事兽医研究所长春130122

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)可感染多种动物宿主并引发败血症和呼吸道疾病,危害动物健康,给养殖业带来严重经济损失。本研究为探究多杀性巴氏杆菌感染期间对宿主肺脏基因表达的影响,选取羊源A型多杀性巴氏杆菌对小鼠(Mus mus... 详细信息

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)可感染多种动物宿主并引发败血症和呼吸道疾病,危害动物健康,给养殖业带来严重经济损失。本研究为探究多杀性巴氏杆菌感染期间对宿主肺脏基因表达的影响,选取羊源A型多杀性巴氏杆菌对小鼠(Mus musculus)进行攻毒实验,攻毒后72 h采集小鼠肺脏组织并提取总RNA。基于转录组测序,与对照组相比,攻毒组获得2443个差异表达基因,其中有1437个基因上调,1006个基因下调。对2443个差异表达基因进行GO富集分析,结果显示,差异基因显著富集的GO terms主要有B细胞稳态、T细胞迁移的正调控、整合素复合物和胶原蛋白结合;KEGG富集分析结果显示,差异基因显著富集于11条免疫炎症信号通路,包括细胞因子与细胞因子受体互作、趋化因子信号通路等;免疫炎症相关信号通路中,差异基因经蛋白质-蛋白质互作分析,结果显示,C3、C3ar1、C5ar1、Cxcl10、Cxcr2和Gng11基因处于网络中心,说明这些基因在多杀性巴氏杆菌感染过程中发挥了重要作用;从11条免疫炎症通路的基因中挑选10个进行实时荧光定量PCR验证,发现有8个基因表达趋势与测序结果相符,说明测序数据可靠。本研究展示了小鼠在多杀性巴氏杆菌感染过程中参与免疫反应的关键基因,为探索宿主抗多杀性巴氏杆菌感染分子机制提供了理论依据。

关键词：多杀性巴氏杆菌小鼠肺脏转录组实时荧光定量PCR

多杀性巴氏杆菌HN06株磷酸甘油酸变位酶gpmA基因的序列分析及其原核表达

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中国兽医科学 2015年第1期45卷 57-60页

作者：曾东柱李慧孔汉金郭锐吴斌华中农业大学动物医学院湖北武汉430070

为探索糖酵解关键酶磷酸甘油酸变位酶的功能,采用PCR方法从多杀性巴氏杆菌HN06株中扩增出了磷酸甘油酸变位酶基因gpmA,将其克隆到表达载体pET-30a(+)中,测序验证后转入表达菌株大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达。结果显示,重组菌可表达... 详细信息

为探索糖酵解关键酶磷酸甘油酸变位酶的功能,采用PCR方法从多杀性巴氏杆菌HN06株中扩增出了磷酸甘油酸变位酶基因gpmA,将其克隆到表达载体pET-30a(+)中,测序验证后转入表达菌株大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达。结果显示,重组菌可表达出分子质量约为32ku的重组融合蛋白,在终浓度为20mmol/L IPTG诱导3h的情况下表达良好。表达的蛋白以可溶性蛋白的形式存在于菌体中。表达产物经Ni柱纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。经过Western-blot分析,所纯化的蛋白能与抗多杀性巴氏杆菌HN06株阳性血清进行特异性的免疫印迹反应,证实表达的蛋白具有良好的反应原性。

关键词：多杀性巴氏杆菌磷酸甘油酸变位酶 gpmA基因原核表达纯化免疫印迹

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多杀性巴氏杆菌的摄铁机制研究进展

畜牧兽医学报 2024年第11期55卷 4852-4862页

作者：沈香香关丽君张俊峰薛云司丽芳赵战勤河南科技大学动物科技学院/洛阳市动物细菌性传染病防控技术重点实验室洛阳471003 河南科技大学动物科技学院/河南省高等学校环境与畜产品安全重点学科开放实验室洛阳471003

多杀性巴氏杆菌可广泛感染多种动物,引起出血性败血症或传染性肺炎。铁是多杀性巴氏杆菌感染宿主过程中生长、定植和增殖必不可少的营养物质,竞争宿主铁离子是该病原体感染致病的关键环节。近年来,多杀性巴氏杆菌的摄铁系统及其发生与... 详细信息

多杀性巴氏杆菌可广泛感染多种动物,引起出血性败血症或传染性肺炎。铁是多杀性巴氏杆菌感染宿主过程中生长、定植和增殖必不可少的营养物质,竞争宿主铁离子是该病原体感染致病的关键环节。近年来,多杀性巴氏杆菌的摄铁系统及其发生与调控机制方面的研究取得了一系列重要进展。本文系统阐述了多杀性巴氏杆菌的转铁蛋白受体摄铁机制、血红素受体摄铁机制、铁载体摄铁机制及其摄铁系统的表达与调控机制,以期为多杀性巴氏杆菌摄铁系统的分子致病机理研究提供系统的理论知识,为多杀性巴氏杆菌分子靶标药物及亚单位疫苗的研发提供新思路。

关键词：多杀性巴氏杆菌摄铁机制铁载体 ExbB-ExbD-TonB Fur

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多杀性巴氏杆菌脂多糖的结构与功能研究进展

畜牧兽医学报 2016年第10期47卷 1961-1968页

作者：华瑞其赵新新程安春四川农业大学动物医学院预防兽医研究所成都611130 四川农业大学动物医学院禽病防治中心成都611130 四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室成都611130

多杀性巴氏杆菌是一种兼性厌氧的革兰阴性菌,能够造成多种动物的巴氏杆菌病。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)既是细菌重要的毒力因子,又是主要的保护性抗原。依据LPS血清学反应,多杀性巴氏杆菌可分为16个血清型。与大多数革兰阴性菌不... 详细信息

多杀性巴氏杆菌是一种兼性厌氧的革兰阴性菌,能够造成多种动物的巴氏杆菌病。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)既是细菌重要的毒力因子,又是主要的保护性抗原。依据LPS血清学反应,多杀性巴氏杆菌可分为16个血清型。与大多数革兰阴性菌不同,多杀性巴氏杆菌的脂多糖不含O-抗原,仅由类脂A和核心寡糖两部分组成。近年来人们通过质谱检测和基因测序陆续揭示了这16个血清型核心寡糖的化学结构和合成基因。研究表明,各血清型内核心寡糖结构十分保守,合成基因分散存在于基因组;外核心寡糖的化学组成具有多样性,其合成基因成簇存在,形成外核心寡糖基因簇。虽然有些血清型共享同样的外核心寡糖基因簇,但由于基因突变造成它们外核心寡糖结构的异质性。研究还发现核心寡糖的结构与多杀性巴氏杆菌的毒力有关。作者在本文中综述了多杀性巴氏杆菌16个血清型的核心寡糖的化学结构、基因组成及其结构与毒力的关系,为多杀性巴氏杆菌病的防治提供借鉴。

关键词：多杀性巴氏杆菌脂多糖化学结构基因组成毒力

多杀性巴氏杆菌Lon蛋白酶的原核表达及ATPase活性的检测

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中国预防兽医学报 2014年第7期36卷 530-533页

作者：王淑亚郭东春李影王雅静刘家森姜骞曲连东东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/自然疫源性人兽共患病研究团队黑龙江哈尔滨150001

为表达多杀性巴氏杆菌(***)Lon蛋白及检测其生物活性,本研究通过PCR扩增*** C51-17株Lon基因,将其克隆到质粒pET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET30a-Lon,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达重组蛋白Lon,采用Ni-NT... 详细信息

为表达多杀性巴氏杆菌(***)Lon蛋白及检测其生物活性,本研究通过PCR扩增*** C51-17株Lon基因,将其克隆到质粒pET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET30a-Lon,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达重组蛋白Lon,采用Ni-NTA His-Bind Resin纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白Lon分子量大小约为97 ku,主要以可溶性蛋白形式表达;western blot检测结果表明,重组表达蛋白能够被***阳性血清识别;ATPase活性检测试验表明,纯化的重组蛋白Lon具有ATPase活性,其将ATP降解为ADP的酶活性可以达到27 708.47μmol/(mg·min)。本研究表达了*** Lon重组蛋白,并且测定其ATPase活性,为进一步研究Lon蛋白在***致病中的作用奠定了基础。

关键词：多杀性巴氏杆菌 Lon蛋白酶原核表达 ATPase活性

多杀性巴氏杆菌OmpH蛋白间接ELISA方法的建立

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中国兽医科学 2024年

作者：王润清孙航阚威李歌李琦侯晓林孙雨北京农学院动物医学院中国动物疫病预防控制中心甘肃农业大学动物医学院青海省动物疫病预防控制中心

本试验在大肠杆菌原核表达系统中诱导出了多杀性巴氏杆菌OmpH抗原，建立了一种牛多杀性巴氏杆菌抗体ELISA检测方法。本试验分析了OmpH序列的信号肽与跨膜疏水区序列，对选择的目的基因片段进行稀有密码子优化，将化学合成后的核苷酸序... 详细信息

本试验在大肠杆菌原核表达系统中诱导出了多杀性巴氏杆菌OmpH抗原，建立了一种牛多杀性巴氏杆菌抗体ELISA检测方法。本试验分析了OmpH序列的信号肽与跨膜疏水区序列，对选择的目的基因片段进行稀有密码子优化，将化学合成后的核苷酸序列连接pET32a载体上，并构建相应的重组质粒pET32a-OmpH，将重组质粒转化进大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞株中，扩大培养并成功诱导表达出了纯度较高的包涵体OmpH蛋白，大小约为57 kDa，蛋白纯度约为94%，且OmpH重组蛋白与其他疫病抗体无非特异性交叉。将纯化后的pET32a-OmpH重组蛋白作为包被抗原，建立了间接ELISA检测方法，该方法特异性强，对其他牛类病原无交叉反应，且其组内与组间变异系数均低于10%，具有良好的稳定性与重复性。本研究为进一步开发成熟的多杀性巴氏杆菌抗体检测试剂盒奠定了基础。

关键词：多杀性巴氏杆菌 OmpH蛋白原核表达蛋白纯化 ELISA

多杀性巴氏杆菌prfA基因的序列分析与原核表达

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中国兽医科学 2014年第3期44卷 293-297页

作者：李影郭东春王淑亚张爱芹胡晓亮王雅静刘家森姜骞曲娟娟曲连东东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

为探索多杀性巴氏杆菌的致病机理，采用PCR方法分别扩增了家兔源和禽源多杀性巴氏杆菌C51—17、Pm898、Pm8916、Pm901、Pr09616、PmZM、PmQin菌株的prfA基因，并对其进行序列分析。将C51—17株的prfA基因克隆到质粒pET30a中，将重组表... 详细信息

为探索多杀性巴氏杆菌的致病机理，采用PCR方法分别扩增了家兔源和禽源多杀性巴氏杆菌C51—17、Pm898、Pm8916、Pm901、Pr09616、PmZM、PmQin菌株的prfA基因，并对其进行序列分析。将C51—17株的prfA基因克隆到质粒pET30a中，将重组表达载体pET30a—prfA转化到大肠杆菌BL21（DE3）pLysS感受态细胞中，经IPTG诱导表达，进行SDS—PAGE分析和Western—blot分析。结果显示，这7株菌株与GenBank登录的3株多杀性巴氏杆菌之间prfA基因在核苷酸水平上的同源性为95．6％～100％，在氨基酸水平上的同源性为98．9％～100％。诱导表达的重组蛋白PrfA的分子质量约为45．6ku，与预期的大小一致，以可溶性形式表达。重组蛋白PrfA可与家兔抗多杀性巴氏杆菌阳性血清反应，具有良好的反应原性。

关键词：多杀性巴氏杆菌 prfA基因序列分析原核表达