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CRISPR/Cas9介导的ASGR1基因敲除猪制备

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农业生物技术学报 2016年第8期24卷 1243-1250页

作者：李西睿冯冲龙川纪慧丽魏静石宁宁曾国敏蒋应弟潘登科田兴华河南大学生命科学学院/生物化学与分子生物学实验室中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室

猪(Sus scrofa)内皮细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因之一。本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除的五指山... 详细信息

猪(Sus scrofa)内皮细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因之一。本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除的五指山小型猪基础上,利用规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)结合体细胞核移植技术制备ASGR1基因敲除猪,针对猪ASGR1基因设计并构建了靶向表达载体单链导向RNA1(single guide RNA1,sg RNA1),将sg RNA1与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)质粒共同电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,流式细胞仪富集筛选带绿色荧光的细胞后培养单细胞克隆。实验结果表明,PCR测序检测培养获得的41个单细胞克隆,37个克隆发生基因突变,ASGR1基因突变效率为90%,其中双等位基因敲除的细胞克隆30个,效率高达73%。选择4个ASGR1基因敲除类型不同的细胞为核供体进行核移植,将早期重构胚移植到4头受体猪,2头妊娠至终期,产仔猪6头,Western blot显示ASGR1基因敲除仔猪的肝脏中没有ASGR1的表达。对sg RNA1的13个潜在脱靶位点,分别设计引物进行PCR扩增和测序,结果显示没有脱靶现象。总之,本研究利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,有望解决异种肝移植后出现的血小板减少症,为临床过渡肝的应用研究提供了良好的研究材料。

关键词：规律成簇间隔短回文重复(CRISPR/Cas9) 去唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1) 异种肝移植体细胞核移植基因敲除猪

ApoE基因敲除巴马猪动脉粥样硬化模型的建立及表型分析

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ApoE基因敲除巴马猪动脉粥样硬化模型的建立及表型分析

作者：方斌南京医科大学

学位级别：硕士

研究背景:随着心血管疾病发病率逐年升高,作为心脑血管疾病基础病因的动脉粥样硬化也受到广泛关注。动脉粥样硬化初期动脉血管壁内膜及内膜下脂质及糖类异常聚集,血管内皮隆起形成粥样病灶或纤维性脂质病变,造成血管管壁变厚,管腔狭窄... 详细信息

研究背景:随着心血管疾病发病率逐年升高,作为心脑血管疾病基础病因的动脉粥样硬化也受到广泛关注。动脉粥样硬化初期动脉血管壁内膜及内膜下脂质及糖类异常聚集,血管内皮隆起形成粥样病灶或纤维性脂质病变,造成血管管壁变厚,管腔狭窄。随着病程进展,动脉粥样硬化斑块会发生破裂,破裂后的斑块脱落,随血流进入循环,在管腔狭窄处形成血栓,阻塞血液流动。载脂蛋白E(Apolipoprotein E,Apo E)蛋白是脂代谢中一个重要的蛋白,Apo E功能缺失会导致脂代谢紊乱,从而加速动脉粥样硬化发病进程。许多科学家使用Apo E转基因小鼠作为动物模型进行动脉粥样硬化研究,但Apo E敲除小鼠并不能很好的模拟人类动脉粥样硬化的病因及病程,因此建立一个合适的动脉粥样硬化模型对于动脉粥样硬化的研究至关重要。本实验室于2016年成功培育出Apo E基因敲除猪,猪的心血管系统及载脂蛋白类型与人类极其相似,与啮齿类动物相比更适合模拟人类动脉粥样硬化病程,敲除Apo E基因会加速动脉粥样硬化的发生及发展,该大动物模型可以为动脉粥样硬化的研究打下基础。目的:培育Apo E基因敲除猪并诱导其产生动脉粥样硬化病变,建立国际上首例动脉粥样硬化Apo E基因敲除猪模型,从而更好的模拟人类动脉粥样硬化的发生发展,帮助科研工作者更深入地研究动脉粥样硬化病变的发生机制,为早日攻克动脉粥样硬化病变积累重要研究数据。方法:使用Western Blot检测新生小猪体内Apo E蛋白的表达情况;在喂食高脂饲料之前测定各头小猪的血脂数据,分析其中差异;喂食高脂饲料来加速Apo E基因敲除猪动脉粥样硬化发病速度,在喂食过程中测定各头小猪体内血脂水平变化,评估造模进程。Western Blot检测高脂饲养后小猪体内的Apo E、Apo B表达并使用油红和H&E染色检测Apo E敲除小猪体内动脉粥样硬化发病情况。结果:通过高脂饲料诱导,Apo E敲除克隆猪在高脂饲养六个月后成功诱导产生了动脉粥样硬化病变并伴有严重的高脂血症,与以往模型相比,Apo E基因敲除克隆猪模型具有发病快和病情稳定的特点,可以为今后动脉粥样硬化的研究提供大量的研究数据。

关键词： CRISPR/Cas9 动脉粥样硬化 ApoE 基因敲除猪

基因组编辑技术介导的猪GGTA1/ASGR1基因敲除研究

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基因组编辑技术介导的猪GGTA1/ASGR1基因敲除研究

作者：李西睿河南大学

学位级别：硕士

供体肝脏的严重短缺是限制临床肝移植的主要瓶颈,利用猪肝脏进行异种肝移植是有望解决临床供肝短缺的有效途径之一。尤其是作为“过渡肝”应用于24h内即会发生死亡的急性肝衰病人的治疗,可以降低病人的死亡率,为后续治疗争取时间。猪-... 详细信息

供体肝脏的严重短缺是限制临床肝移植的主要瓶颈,利用猪肝脏进行异种肝移植是有望解决临床供肝短缺的有效途径之一。尤其是作为“过渡肝”应用于24h内即会发生死亡的急性肝衰病人的治疗,可以降低病人的死亡率,为后续治疗争取时间。猪-人异种肝脏移植面临诸多障碍,其中超急性免疫排斥反应和血小板减少症是两个首要攻克难题。猪α-1,3-半乳糖基转移酶基因(?-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)催化形成的αGal表位抗原,与人体天然存在的αGal表位抗体结合会引发超急性免疫排斥反应。表达于猪肝窦内皮细胞和Kuffer细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor,ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因。本研究利用基因组编辑技术转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription Activator-like(TAL)Effector Nucleases,TALENs)和规律成簇间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)分别介导猪GGTA1和ASGR1基因的敲除,结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,在避免超急性排斥反应的同时减缓血小板减少症,以期为异种肝移植的研究提供更好的材料。本学术论文有两项研究内容,研究结果如下:1、利用TALEN技术高效制备GGTA1基因敲除五指山小型猪。针对猪GGTA1基因第4外显子设计并构建两对TALENs打靶载体,将TALEN mRNA电转染猪耳成纤维细胞,经传代培养后采用免疫磁珠法高效富集获得47个单细胞克隆,PCR测序鉴定均为GGTA1基因突变细胞,基因编辑效率高达100%。选择6种不同突变类型的GGTA1双等位基因敲除细胞为核供体进行体细胞核移植,共移植6头受体母猪,6头均妊娠至终期共产克隆仔猪23头,采集仔猪耳组织样提取基因组DNA进行PCR测序鉴定,证实全部为GGTA1基因敲除仔猪。对TALEN的17个潜在脱靶位点设计引物,PCR目的片段后测序,未发现脱靶现象。流式细胞术分析结果显示,仔猪α-Gal表位成功去除。血清裂解结果显示,GGTA1基因敲除猪细胞能够有效抵抗正常人血清的排斥反应,表明有效克服了超急性免疫排斥。上述结果表明,TALEN技术结合免疫磁珠方法可高效敲除GGTA1基因,通过体细胞核移植技术快速获得GGTA1双等位基因敲除仔猪,成功克服了超急性免疫排斥。2、本研究在GGTA1敲除的五指山小型猪基础上,利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术制备ASGR1基因敲除猪,为异种肝移植后血小板减少症的研究提供良好的动物模型。针对猪ASGR1基因设计并构建了靶向表达载体单链导向RNA1(single guide RNA1,sgRNA1),将sgRNA1与增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)质粒共同电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,流式细胞术富集表达绿色荧光的细胞后培养单细胞克隆。实验结果表明,共挑取细胞克隆41个,经PCR产物测序,其中37个克隆发生基因突变,ASGR1基因突变效率为90%;双等位基因敲除的细胞克隆30个,双等位基因敲除效率为73%。选择四个ASGR1基因敲除类型不同的细胞为核供体进行核移植至4头受体猪,2头妊娠至终期,产仔猪6头,经PCR产物测序,所有6头仔猪均为ASGR1基因敲除猪;Western Blot显示ASGR1基因敲除仔猪的肝脏中没有ASGR1的表达。对sgRNA1的13个潜在脱靶位点,分别设计引物进行PCR扩增和测序,未检测到脱靶现象。总之,本研究利用CRISPR/Cas9快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,有望解决异种肝移植后出现的血小板减少症。综上所述,本研究利用基因组编辑技术在猪体细胞实现了精确的基因编辑,结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,克服了异种肝移植后发生的超急性免疫排斥,有望解决术后出现的血小板减少症,为临床过渡肝的应用研究提供了良好的研究材料。

关键词：异种肝移植基因组编辑技术 GGTA1基因 ASGR1基因基因敲除猪

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对“基因工程”专题中几个疑难问题的解析

生物学教学 2015年第1期40卷 75-76页

作者：刘欣北京师范大学附属中学

本文对＂基因工程＂专题中＂为什么转入病毒基因可使植物获得抗病毒能力＂、＂为什么利用基因工程方法能除去猪的抗原决定基因＂、＂蛋白质工程中怎样实现对目的基因的定向改造＂等问题进行了简要解析。

关键词：转基因植物抗病毒机理基因敲除猪定点诱变

利用CRISPR/Cas9技术构建ApoE-/-猪模型

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利用CRISPR/Cas9技术构建ApoE-/-猪模型

作者：袁益琳南京医科大学

学位级别：硕士

研究背景：心脑血管疾病是全世界主要的致死性疾病,动脉粥样硬化是其重要的病理基础。高脂血症和高胆固醇血症被认为是动脉粥样硬化发病及发展的重要因素。载脂蛋白E(ApoE)在胆固醇和脂蛋白的转运和代谢中发挥重要作用。ApoE基因敲除小... 详细信息

研究背景：心脑血管疾病是全世界主要的致死性疾病,动脉粥样硬化是其重要的病理基础。高脂血症和高胆固醇血症被认为是动脉粥样硬化发病及发展的重要因素。载脂蛋白E(ApoE)在胆固醇和脂蛋白的转运和代谢中发挥重要作用。ApoE基因敲除小鼠的广泛应用,使得动脉粥样硬化早期病理机制的研究取得了很大进展。但ApoE敲除小鼠与人类在动脉粥样硬化病理机制上相去甚远。猪因为在解剖学和生理上和人类似,适合于建立动脉粥样硬化大动物模型。目的：通过敲除猪的ApoE基因,建立国际上首批ApoE基因敲除猪,培育动脉粥样硬化的猪模型,能更好地研究动脉粥样硬化的发病机理,同时为进一步研究动脉粥样硬化的预防治疗打下基础。方法：设计合适的ApoE基因敲除的CRISPR/Cas9靶点,并组装CRISPR/Cas9打靶质粒;通过CRISPR/Cas9质粒与表达G418抗性的tdTomato质粒共转染猪胎儿成纤维细胞,经过抗性筛选和PCR产物测序的方式鉴定出ApoE基因双敲的单细胞克隆;以筛选获得的ApoE基因双敲的猪胎儿成纤维细胞单克隆作为体细胞核移植供体,通过体细胞核移植(SCNT)技术,构建国际上首例ApoE基因双敲的克隆猪。对于构建的克隆小猪,提取耳部组织基因组DNA后,PCR测序鉴定其ApoE的基因型。结果：根据选取的ApoE靶点位置,设计并成功组装CRISPR/Cas9打靶质粒,CRISPR/Cas9质粒转染猪原代成纤维细胞,筛选得到ApoE等位基因双突变的中华小型猪单细胞克隆个数为14个,ApoE等位基因双突变的巴马猪单细胞克隆个数为27个。将CRISPR/Cas9筛选获得ApoE双敲突变细胞作为核移植供体,应用体细胞核移植技术,成功获得了17头ApoE敲除猪。结论：应用CRISPR/Cas9系统,结合体细胞核移植技术可以一步成功构建ApoE纯合敲除猪模型。我们的结果不仅证实了CRISPR/Cas9系统是构建基因改造猪的高效工具,而且还为利用ApoE基因敲除猪研究动脉粥样硬化的发病机理和预防治疗打下基础。

关键词： CRISPR/Cas9 基因敲除猪载脂蛋白E 动脉粥样硬化

利用CRISPR/Cas9技术构建LDLR/ApoE双基因缺陷猪模型以及二十二碳六烯酸对神经胶质瘤转录组影响研究

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利用CRISPR/Cas9技术构建LDLR/ApoE双基因缺陷猪模型以及二十二碳...

作者：阮苗苗南京医科大学

学位级别：硕士

研究背景:动脉粥样硬化主要是由血脂的不平衡引起的,特别是低密度脂蛋白代谢障碍。载脂蛋白E(ApoE)和低密度脂蛋白受体(LDLR)基因突变在动脉粥样硬化的发生发展过程中起着十分重要的作用。ApoE蛋白的功能缺陷会导致Ⅲ型高脂蛋白血症(HLP... 详细信息

研究背景:动脉粥样硬化主要是由血脂的不平衡引起的,特别是低密度脂蛋白代谢障碍。载脂蛋白E(ApoE)和低密度脂蛋白受体(LDLR)基因突变在动脉粥样硬化的发生发展过程中起着十分重要的作用。ApoE蛋白的功能缺陷会导致Ⅲ型高脂蛋白血症(HLPⅢ)。肝细胞表面的LDLR蛋白对于肝脏中胆固醇(LDL-C)的清除起着至关重要的作用,LDLR基因功能的缺失导致在血液循环中过度积累LDL-C,并引起家族性高胆固醇血症(FH)。在动脉粥样硬化的研究中,广泛使用的模式动物主要有大鼠、小鼠及仓鼠。然而,鼠的外形和新陈代谢与人类相差很大,且鼠不会自发发生动脉粥样硬化,且形成斑块后不会斑块破裂。与此同时,猪被广泛应用于生物医学和人类疾病研究,并且小型猪在冠状动脉解剖学、血流动力学、血脂蛋白表达谱等方面与人类有很高的相似性,能够模拟人类易损斑块形成和进展、自发性斑块破裂伴血栓形成,是构建动脉粥样硬化大动物模型的理想试验动物。目的:通过同时敲除巴马小型猪的ApoE、LDLR两个基因,使动物自发产生高脂血症,拟建立一种易损斑块形成发生率高、试验周期短、操作简便且稳定的动脉易损斑块动物模型。为研究动脉粥样硬化的发病机制提供素材,并为诊断、预防急性心脏事件和稳定斑块提供新思路和新方法方法:1、根据NCBI官网检索的猪的LDLR、ApoE基因序列,在相应位点设计CRISPR/Cas9打靶位点,成功构建CRISPR/Cas9打靶质粒。2、打靶质粒与含有G418抗性的td-Tomato质粒共转染进入巴马猪原代成纤维细胞,经过药物筛选,挑取细胞单克隆,PCR后测序鉴定细胞单克隆基因型。3、得到的LDLR/ApoE双基因敲除的细胞用于体细胞克隆,发育至囊胚阶段移植到代孕母猪子宫。4、代孕母猪生出健康克隆巴马猪,剪取新生猪耳组织,提取基因组进行基因型鉴定,检测新生LDLR/ApoE双基因敲除猪的血脂,western-blot检测LDLR、ApoE蛋白表达情况。结果:成功构建靶向LDLR、ApoE的CRISPR/Cas9打靶质粒。转染成纤维细胞后共获得雌性LDLR/ApoE双基因敲除细胞单克隆2株,雄性LDLR/ApoE双基因敲除细胞12株。将鉴定后的细胞单克隆用于体细胞核移植,成功获得9头雌性、33头雄性LDLR/ApoE双基因敲除巴马新生猪。断奶一个月血脂检测结果显示,LDLR/ApoE双基因敲除猪LDL-c、TC水平均高于野生型(P基因编辑技术,结合SCNT技术,成功获得LDLR/ApoE双基因敲除猪模型。我们的结果不仅证实了CRISPR/Cas9基因编辑系统可以高效地对猪的基因进行编辑,还为进一步研究动脉粥样硬化的发生发展机制提供了很好的大动物模型。研究背景:神经胶质瘤是危害人们身体健康的主要颅内肿瘤之一,是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤。目前对神经胶质瘤的治疗以手术治疗为主,除早期肿瘤小且位于适当部位者外,难以做到全部切除。因此,目前尚无安全有效的治疗方法。二十二碳六烯酸(DHA)是ω-3多不饱和脂肪酸家族中的重要成员。研究发现DHA能够抑制神经母细胞瘤癌细胞,表明DHA或可成为一种新的治疗神经母细胞瘤或其他癌症的新药物。但是DHA调控神经胶质瘤分子机制尚不清楚,需进一步深入研究。在高通量测序技术出现以前,对于肿瘤发生机制的研究仅仅局限于一个基因或几个基因,无法系统的对肿瘤的发生发展进行研究。近年来,转录组测序(RNA-sequencing,RNA-seq)技术的发展为从整体层面研究肿瘤的发生发展提供了技术支持。以往的研究认为,癌症是基因源性疾病。然而,近期研究发现,基因表观遗传水平的异常对肿瘤的发生发展起着十分重要的影响。其中长链非编码RNA(Long non-coding RNA,Lnc RNA)和微小RNA(Micro RNA,mi RNA)是研究最多的两种具有调节功能的RNA。近年来,越来越多的研究发现Lnc RNA参与肿瘤细胞的调控。共表达网络分析发现Lnc RNA表达水平的改变与核心癌症基因的表达具有显著的相关性。这提示Lnc RNA可以作为治疗癌症的一种新的靶点。然而,目前关于DHA具体通过哪些基因对神经胶质瘤进行调控尚不清楚,以及DHA是否通过影响Lcn RNA的表达来调控神经胶质瘤也不清楚。因此,本研究将利用转录组测序来筛选DHA处理神经胶质瘤细胞后差异表达的基因和Lnc RNA。目的:探讨多不饱和脂肪酸DHA对神经胶质瘤U251细胞增殖、凋亡、侵袭和转移调控的分子机制。方法:用CCK-8试剂盒检测DHA对U251细胞增殖的影响;通过细胞划痕实验及transwell小室实验检测DHA对U251细胞迁移和侵袭功能的影响;用流式细胞实验检测DHA对U251细胞凋亡的影响。U251使用DHA处理后,

关键词： CRISPR/Cas9 载脂蛋白E 低密度脂蛋白受体基因敲除猪动脉粥样硬化神经胶质瘤二十二碳六烯酸转录组测序长链非编码RNA