利用CRISPR/Cas9技术构建LDLR/ApoE双基因缺陷猪模型以及二十二碳六烯酸对神经胶质瘤转录组影响研究

作     者：阮苗苗 

作者单位：南京医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：戴一凡

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：CRISPR/Cas9 载脂蛋白E 低密度脂蛋白受体 基因敲除猪 动脉粥样硬化 神经胶质瘤 二十二碳六烯酸 转录组测序 长链非编码RNA 

摘      要：研究背景:动脉粥样硬化主要是由血脂的不平衡引起的,特别是低密度脂蛋白代谢障碍。载脂蛋白E(ApoE)和低密度脂蛋白受体(LDLR)基因突变在动脉粥样硬化的发生发展过程中起着十分重要的作用。ApoE蛋白的功能缺陷会导致Ⅲ型高脂蛋白血症(HLPⅢ)。肝细胞表面的LDLR蛋白对于肝脏中胆固醇(LDL-C)的清除起着至关重要的作用,LDLR基因功能的缺失导致在血液循环中过度积累LDL-C,并引起家族性高胆固醇血症(FH)。在动脉粥样硬化的研究中,广泛使用的模式动物主要有大鼠、小鼠及仓鼠。然而,鼠的外形和新陈代谢与人类相差很大,且鼠不会自发发生动脉粥样硬化,且形成斑块后不会斑块破裂。与此同时,猪被广泛应用于生物医学和人类疾病研究,并且小型猪在冠状动脉解剖学、血流动力学、血脂蛋白表达谱等方面与人类有很高的相似性,能够模拟人类易损斑块形成和进展、自发性斑块破裂伴血栓形成,是构建动脉粥样硬化大动物模型的理想试验动物。目的:通过同时敲除巴马小型猪的ApoE、LDLR两个基因,使动物自发产生高脂血症,拟建立一种易损斑块形成发生率高、试验周期短、操作简便且稳定的动脉易损斑块动物模型。为研究动脉粥样硬化的发病机制提供素材,并为诊断、预防急性心脏事件和稳定斑块提供新思路和新方法方法:1、根据NCBI官网检索的猪的LDLR、ApoE基因序列,在相应位点设计CRISPR/Cas9打靶位点,成功构建CRISPR/Cas9打靶质粒。2、打靶质粒与含有G418抗性的td-Tomato质粒共转染进入巴马猪原代成纤维细胞,经过药物筛选,挑取细胞单克隆,PCR后测序鉴定细胞单克隆基因型。3、得到的LDLR/ApoE双基因敲除的细胞用于体细胞克隆,发育至囊胚阶段移植到代孕母猪子宫。4、代孕母猪生出健康克隆巴马猪,剪取新生猪耳组织,提取基因组进行基因型鉴定,检测新生LDLR/ApoE双基因敲除猪的血脂,western-blot检测LDLR、ApoE蛋白表达情况。结果:成功构建靶向LDLR、ApoE的CRISPR/Cas9打靶质粒。转染成纤维细胞后共获得雌性LDLR/ApoE双基因敲除细胞单克隆2株,雄性LDLR/ApoE双基因敲除细胞12株。将鉴定后的细胞单克隆用于体细胞核移植,成功获得9头雌性、33头雄性LDLR/ApoE双基因敲除巴马新生猪。断奶一个月血脂检测结果显示,LDLR/ApoE双基因敲除猪LDL-c、TC水平均高于野生型(P0.05)。结论:本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,结合SCNT技术,成功获得LDLR/ApoE双基因敲除猪模型。我们的结果不仅证实了CRISPR/Cas9基因编辑系统可以高效地对猪的基因进行编辑,还为进一步研究动脉粥样硬化的发生发展机制提供了很好的大动物模型。研究背景:神经胶质瘤是危害人们身体健康的主要颅内肿瘤之一,是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤。目前对神经胶质瘤的治疗以手术治疗为主,除早期肿瘤小且位于适当部位者外,难以做到全部切除。因此,目前尚无安全有效的治疗方法。二十二碳六烯酸(DHA)是ω-3多不饱和脂肪酸家族中的重要成员。研究发现DHA能够抑制神经母细胞瘤癌细胞,表明DHA或可成为一种新的治疗神经母细胞瘤或其他癌症的新药物。但是DHA调控神经胶质瘤分子机制尚不清楚,需进一步深入研究。在高通量测序技术出现以前,对于肿瘤发生机制的研究仅仅局限于一个基因或几个基因,无法系统的对肿瘤的发生发展进行研究。近年来,转录组测序(RNA-sequencing,RNA-seq)技术的发展为从整体层面研究肿瘤的发生发展提供了技术支持。以往的研究认为,癌症是基因源性疾病。然而,近期研究发现,基因表观遗传水平的异常对肿瘤的发生发展起着十分重要的影响。其中长链非编码RNA(Long non-coding RNA,Lnc RNA)和微小RNA(Micro RNA,mi RNA)是研究最多的两种具有调节功能的RNA。近年来,越来越多的研究发现Lnc RNA参与肿瘤细胞的调控。共表达网络分析发现Lnc RNA表达水平的改变与核心癌症基因的表达具有显著的相关性。这提示Lnc RNA可以作为治疗癌症的一种新的靶点。然而,目前关于DHA具体通过哪些基因对神经胶质瘤进行调控尚不清楚,以及DHA是否通过影响Lcn RNA的表达来调控神经胶质瘤也不清楚。因此,本研究将利用转录组测序来筛选DHA处理神经胶质瘤细胞后差异表达的基因和Lnc RNA。目的:探讨多不饱和脂肪酸DHA对神经胶质瘤U251细胞增殖、凋亡、侵袭和转移调控的分子机制。方法:用CCK-8试剂盒检测DHA对U251细胞增殖的影响;通过细胞划痕实验及transwell小室实验检测DHA对U251细胞迁移和侵袭功能的影响;用流式细胞实验检测DHA对U251细胞凋亡的影响。U251使用DHA处理后,