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作者：刘丽萍华北理工大学

学位级别：硕士

目的利用生物信息学、免疫组化及体外细胞实验检测坍塌反应调节蛋白1(Collapse response mediator protein 1,CRMP1)在上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)中的表达,探讨CRMP1在卵巢癌中的意义以及对卵巢癌恶性生物学行为的影... 详细信息

目的利用生物信息学、免疫组化及体外细胞实验检测坍塌反应调节蛋白1(Collapse response mediator protein 1,CRMP1)在上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)中的表达,探讨CRMP1在卵巢癌中的意义以及对卵巢癌恶性生物学行为的影响。方法1通过利用GEPIA、Kaplan-Meier Plotter和TIMER三种生物信息分析工具分析CRMP1在卵巢癌中的表达水平及CRMP1与患者病理分期、临床预后及免疫细胞浸润之间的关系。2收集2016年1月至2021年1月于河北省人民医院经手术切除卵巢组织的患者病理切片,按照病理证实的卵巢组织良恶性将研究对象分为两个组:即上皮性卵巢癌组(25例)和正常卵巢组(25例)。在上皮性卵巢癌及正常卵巢的病理组织切片中,利用免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)技术测量CRMP1、P53及P21的表达水平并进行统计分析。3体外成功培养卵巢癌OVCAR3细胞,通过质粒转染技术调控CRMP1蛋白表达量。根据处理方式的不同将OVCAR3细胞分为3组,其中转染CRMP1基因过表达质粒(pcDNA3.1(+)/CRMP1)的细胞作为实验组,转染空载体质粒(pcDNA3.1(+))的细胞作为阴性对照组,未进行转染的细胞作为空白对照组。进一步应用蛋白质印迹法(Western blotting,WB)测量CRMP1、P53及P21在三组细胞中的蛋白表达量,三组细胞的迁移能力则通过细胞划痕实验来验证。结果1 GEPIA结果表明,相比于正常卵巢组织中的表达量,CRMP1在卵巢癌组织中更低,不同病理分期的卵巢癌患者CRMP1表达水平无统计学差异(F value=1.05,P=0.351)。Kaplan-Meier Plotter结果表明CRMP1高表达的患者拥有更长的无复发生存期(Relapse-free survival,RFS)(HR=0.82,P=0.0049)及总生存期(Overall survival,OS)(HR=0.85,P=0.032)。TIMER结果表明CRMP1的表达与肿瘤纯度、CD4T细胞之间无明显的相关性(P>0.05),但是与B细胞、CD8T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及树突状细胞之间呈负相关。2免疫组化结果表明,CRMP1及P53蛋白在卵巢癌组的阳性表达率显著高于正常卵巢组,但是P21蛋白在两组中均无明显表达。3在空白对照组及阴性对照组中,WB结果表明CRMP1蛋白表达量呈低水平,P53及P21蛋白表达量呈高水平。在转染CRMP1过表达质粒的实验组中,CRMP1蛋白表达量明显升高,同时P53蛋白表达量也较前增高(P蛋白表达量较前未见明显改变(P>0.05)。4细胞划痕实验结果表明,细胞培养48小时后,空白对照组与阴性对照组之间的细胞迁移能力较强,且两组之间无明显差异(P>0.05),但实验组的细胞迁移能力显著降低(P蛋白水平的CRMP1在卵巢癌组织中的表达较正常卵巢组织高。CRMP1表达上调后可以抑制卵巢癌OVCAR3细胞的迁移能力,该过程涉及到P53蛋白的参与,预测CRMP1作为一种肿瘤抑制因子参与卵巢癌的发生发展过程。图5幅;表3个;参120篇。

关键词：坍塌反应调节蛋白1 上皮性卵巢癌 P53 P21 免疫组织化学

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CRMP1 基因慢病毒干扰质粒的构建及其对 SH-SY5Y中NLRP3炎症小体蛋白表达的影响

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中国免疫学杂志 2023年

作者：王松豪秦坤韩雨张微微徐绍业邵晓云桂林医学院人体解剖学教研室桂林医学院科学实验中心

目的：构建靶向坍塌反应调节蛋白1（CRMP1）基因慢病毒干扰质粒，建立稳定敲减CRMP1的人母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）稳转细胞系，探讨其对NLRP3炎症小体蛋白表达的影响。方法：以h-CRMP1 mRNA为靶序列设计合成shRNA双链，将其克隆至PLKO.1... 详细信息

目的：构建靶向坍塌反应调节蛋白1（CRMP1）基因慢病毒干扰质粒，建立稳定敲减CRMP1的人母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）稳转细胞系，探讨其对NLRP3炎症小体蛋白表达的影响。方法：以h-CRMP1 mRNA为靶序列设计合成shRNA双链，将其克隆至PLKO.1载体，构建CRMP1重组干扰质粒。将重组正确的shCRMP1质粒转染HEK-293T细胞进行慢病毒包装，将获得的慢病毒上清液浓缩后感染SH-SY5Y细胞，Western blot检测SH-SY5Y细胞内CRMP1的干扰效果以及对NLRP3炎症小体各组分蛋白表达的影响。结果：测序结果显示，shCRMP1慢病毒干扰质粒构建成功；转染HEK-293T细胞包装慢病毒后，细胞内CRMP1蛋白表达下降；慢病毒浓缩液感染SH-SY5Y细胞经嘌呤霉素筛选，Western blot结果发现shCRMP1慢病毒能显著下调SH-SY5Y细胞中CRMP1的蛋白表达量。同时，在稳定敲减CRMP1的SH-SY5Y细胞系中发现，在MPP+诱导作用下，抑制CRMP1表达可有效抑制NLRP3炎症小体活化。结论：成功构建pLKO.1-shCRMP1慢病毒干扰质粒，且干扰CRMP1后可抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞中NLRP3炎症小体的活化，为进一步研究CRMP1在帕金森病等神经退行性疾病的发生机制奠定基础。

关键词：坍塌反应调节蛋白1 慢病毒干扰人神经母细胞瘤细胞 NLRP3炎症小体

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CRMP-1真核表达载体的构建

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中国医科大学学报 2011年第4期40卷 293-296页

作者：乔宠常瑞晶王春辉中国医科大学附属盛京医院妇产科沈阳110004 中国人民解放军沈阳军区总医院肝胆外科沈阳110016

目的构建人坍塌反应调节蛋白1(CRMP-1)基因表达载体,以研究CRMP-1蛋白在目的细胞中的生物学功能。方法从购买的人胚肾细胞株293T中提取总RNA,经过RT-PCR方法扩增含人CRMP-1基因的全长cDNA,将CRMP-1基因开放阅读框(ORF)cDNA序列,克隆到... 详细信息

目的构建人坍塌反应调节蛋白1(CRMP-1)基因表达载体,以研究CRMP-1蛋白在目的细胞中的生物学功能。方法从购买的人胚肾细胞株293T中提取总RNA,经过RT-PCR方法扩增含人CRMP-1基因的全长cDNA,将CRMP-1基因开放阅读框(ORF)cDNA序列,克隆到真核表达载体p3x-FLAG-myc-CMV-24中,构建真核表达质粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24。以酶切和基因序列测定方法鉴定重组质粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24的正确性。结果酶切鉴定和基因序列测定均证实重组质粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24构建正确。结论成功构建人CRMP-1基因真核表达载体。

关键词：坍塌反应调节蛋白1 基因克隆真核表达载体

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大鼠CRMP1基因siRNA的筛选

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暨南大学学报（自然科学与医学版） 2010年第6期31卷 560-564页

作者：张忠其李斌陈万群张文斌龚晓兵郭国庆暨南大学医学院人体解剖学教研室暨南大学医学院生物化学教研室广东广州510632 暨南大学附属第一医院外科暨南大学附属第一医院消化内科人工肝室广东广州510630

目的:筛选有效抑制大鼠CRMP1基因表达的siRNA序列。方法:化学合成3对针对大鼠CRMP1基因的特异性siRNA,用脂质转染胺(lipofectamine)LTX转染大鼠海马神经元,通过流式细胞仪检测转染效率,使用RT-PCR与实时PCR检测CRMP1基因mRNA的表达,从... 详细信息

目的:筛选有效抑制大鼠CRMP1基因表达的siRNA序列。方法:化学合成3对针对大鼠CRMP1基因的特异性siRNA,用脂质转染胺(lipofectamine)LTX转染大鼠海马神经元,通过流式细胞仪检测转染效率,使用RT-PCR与实时PCR检测CRMP1基因mRNA的表达,从而筛选抑制效率最高的siRNA。结果:流式细胞仪检测转染效率为52.5%。通过RT-PCR的初步检测和实时PCR的定量检测结果显示,与对照组相比,所设计的3对siRNA均能不同程度抑制CRMP1基因mRNA的表达,其中CRMP1-249 siRNA抑制效果最佳,抑制率达84.3%。结论:成功筛选出1对能有效抑制大鼠CRMP1基因表达的siRNA序列。

关键词：小干扰RNA 坍塌反应调节蛋白1 实时荧光定量PCR 大鼠

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siRNA干扰CRMP1对大鼠海马神经元突起生长和细胞骨架的影响

siRNA干扰CRMP1对大鼠海马神经元突起生长和细胞骨架的影响

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作者：张忠其暨南大学

学位级别：硕士

目的：探讨坍塌反应调节蛋白1(Collapsin response mediator protein 1, CRMP1)对大鼠海马神经元突起生长和细胞骨架的影响。材料和方法：化学合成3对靶向大鼠海马神经元CRMP1基因的siRNA,通过RT-PCR与实时荧光定量PCR筛选干扰CRMP1表达... 详细信息

目的：探讨坍塌反应调节蛋白1(Collapsin response mediator protein 1, CRMP1)对大鼠海马神经元突起生长和细胞骨架的影响。材料和方法：化学合成3对靶向大鼠海马神经元CRMP1基因的siRNA,通过RT-PCR与实时荧光定量PCR筛选干扰CRMP1表达的siRNA,并用免疫细胞荧光和Western blot检测CRMP1的表达,然后合成5'端标记FAM绿色荧光基团筛选后的siRNA序列,阳离子脂质体转染原代培养大鼠海马神经元,荧光显微镜下观察绿色荧光在神经元内的表达部位并定时追踪神经元突起的生长,共聚焦显微镜观察α-tubulin、CRMP5蛋白的重排与分布,蛋白印记检测α-tubulin、CRMP5蛋白的表达量。结果：(1)转染效率的检测：阳离子脂质体法将FAM标记的阴性对照siRNA瞬时转染大鼠海马神经元,流式细胞仪检测转染效率为52.5%。(2) CRMP1-siRNA的筛选：化学合成3对针对CRMP1基因的siRNAs序列,通过RT-PCR、实时荧光定量PCR、免疫细胞荧光和Western blot成功筛选出1对有效siRNA,其中CRMP1-249 siRNA能有效抑制CRMP1 mRAN的表达,抑制效率达84.3%,蛋白表达下降了22.4%。(3) CRMP1-siRNA在细胞内分布：转染CRMP1-249 siRNA后,FAM标记的有效siRNA绿色荧光主要分布于神经元胞体、突起和生长锥。(4)细胞生长追踪结果：转染CRMP1-249 siRNA 6h后开始追踪神经元生长过程,发现32 h后CRMP1-249组神经元细胞形态发生明显改变,胞体开始坍塌,突起出现回缩,一级突起与二级突起数量及长度较空白对照组有统计学差异(P蛋白印记检测结果：α-tubulin、CRMP5蛋白主要分布于神经元胞体、突起以及生长锥,实验组抗原荧光强度明显弱于对照组。蛋白印记检测结果显示α-tubulin、CRMP5蛋白的表达量分别下降了47.7%和53%,较空白对照组有统计学差异(P蛋白表达明显减少。

关键词：坍塌反应调节蛋白1 RNA干扰突起生长神经元海马大鼠

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