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两株地丝霉属真菌发酵产物的分离纯化及结构鉴定研究

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两株地丝霉属真菌发酵产物的分离纯化及结构鉴定研究

作者：周晓怡上海中医药大学

学位级别：硕士

目的:本文通过前期活性筛选得到两株地丝霉属真菌,对其次级代谢产物进行研究,为真菌类中药次级代谢产物的研究积累经验和方法。方法:本文通过抗菌和细胞毒活性筛选得到两株菌株,然后优化两株地丝霉属真菌Geomyces destructans R-S60-1和... 详细信息

目的:本文通过前期活性筛选得到两株地丝霉属真菌,对其次级代谢产物进行研究,为真菌类中药次级代谢产物的研究积累经验和方法。方法:本文通过抗菌和细胞毒活性筛选得到两株菌株,然后优化两株地丝霉属真菌Geomyces destructans R-S60-1和Geomyces pannorum SA3-2-YM的发酵条件,使用优化后的培养条件对两株菌株进行规模发酵。将两株菌株发酵得到的粗提物采用多种柱色谱分离方法,再结合现代波谱技术,例如核磁、质谱等手段对分离得到的化合物结构进行解析,然后对鉴定得到的化合物进行了抗菌活性和细胞毒活性的检测。此外,通过HPLC分析不同属真菌的粗提物中含色氨酸结构的环二肽类化合物的情况。结果:从Geomyces pannorum SA3-2-YM发酵粗提物中共分离鉴定了13个化合物,分别是cyclo-（L-Trp-L-Pro）（1）,cyclo-（L-Trp-L-Tyr）（2）,cyclo-（Gly-L-Trp）（3）,cyclo-（L-Trp-L-Phe）（4）,cyclo-（L-Trp-L-Ser）（5）,cyclo-（L-Tyr-L-Pro）（6）,cyclo-（LTrp-D-Ile）（7）,cyclo-（D-Ala-D-Trp）（8）,ergosterol（9）,（22E）-5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol（10）,anicequol（11）,indazole（12）,p-Hydroxybenzaldehyde（13）,包含八个环二肽类化合物、三个甾体类化合物和两个其他类化合物。其中,化合物1-9、11-13为首次从地丝霉菌属中分离得到。从Geomyces destructans R-S60-1发酵粗提物中共分离鉴定了23个化合物,分别是brevianamide F（14）,cyclo-（L-Trp-DVal）（15）,cyclo-（L-Trp-L-Ile）（16）,cyclo-（D-Trp-D-Ala）（17）,cyclo-（L-Trp-Gly）（18）,cyclo-（L-Trp-L-Ser）（19）,cyclo-（L-Trp-L-Tyr）（20）,melithasterol B（21）,22E-7α-methoxy-5α,6α-epoxyergosta-8（14）,22-dien-3β-ol（22）,inoterpene B（23）,3-methly-6-quinoxalinol（24）,indazole（25）,3-Indole acetic acid（26）,N-[(2-（1H-indol-3-yl）ethyl]acetamide（27）,2-（1-Hydroxyethyl）-4（3H）quinazolinone（28）,1-（5′-O-Acetyl-α-D-arabinofuranosyl）thymine（29）,β-adenosine（30）,5’-dcoxy-5’-methylsulphinyladenosine（31）,butyl-α-D-glucopyranoside（32）,海藻糖（33）,（4E,8E）-N-D-2′-Hydroxypalmitoyl-1-O-β-D-glycopyra-nosyl-9-methyl-4,8-sphingadienine（34）,4-hydroxyphenethyl 2-（4-hydroxyphenyl）acetate（35）,2-（4-hydroxyphenyl）ethanol（36）,包含七个环二肽类化合物、三个甾体和三萜类化合物、八个杂环类化合物及五个其他类化合物。其中,化合物14-36为首次从地丝霉菌属中分离得到。对从两株地丝霉属真菌发酵粗提物中分离得到的化合物1-36进行了抗菌和细胞毒活性的检测。结果表明:从SA3-2-YM菌株发酵粗提物分离得到的化合物中,化合物9对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草杆菌具有一定的抗菌活性,其MIC均为90μg/m L;当化合物浓度为20μg/m L时,除化合物6和11无细胞毒活性外,其他化合物对He La（人宫颈癌细胞）、HepG2（人肝癌细胞）、SMMC-7721（人肝癌细胞）、MCF-7（人乳腺癌细胞）有不同程度的抑制活性,对HepG2细胞株的抑制活性总体表现较好。此外,通过HPLC分析不同属真菌和地丝霉属真菌发酵粗提物,发现选取的其他属真菌的粗提物不能和色氨酸环二肽对照品相对应,初步推测其他属真菌粗提物中不含有色氨酸环二肽。结论:两株地丝霉属真菌采用文中的培养方法得到的次级代谢产物主要为环二肽类、甾体类、杂环类化合物,部分化合物具有一定的细胞毒和抗菌活性,地丝霉属真菌在使用文中培养条件发酵时易产生含色氨酸结构的环二肽类化合物。

关键词：真菌地丝霉属化学成分结构鉴定生物活性

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1株南极真菌的鉴定及其分泌色素性质分析

中国食品学报 2013年第3期13卷 189-195页

作者：王风芹许宾孙云飞臧家业李雪梅王能飞河南农业大学生命科学学院郑州450002 国家海洋局第一海洋研究所山东青岛266061 青岛科技大学化学与分子工程学院山东青岛266042

从南极土壤中分离得到1株分泌紫红色色素的真菌WNF-15A,通过菌落特征、显微形态观察和ITS序列分析,将其归为地丝霉属(Geomyces)。该菌最适生长温度范围15～20℃,属于嗜冷真菌。其分泌色素为水溶性,在波长533nm处有最大吸收峰。采用反应... 详细信息

从南极土壤中分离得到1株分泌紫红色色素的真菌WNF-15A,通过菌落特征、显微形态观察和ITS序列分析,将其归为地丝霉属(Geomyces)。该菌最适生长温度范围15～20℃,属于嗜冷真菌。其分泌色素为水溶性,在波长533nm处有最大吸收峰。采用反应动力学的方法对色素的热降解进行了研究,其热降解符合Ar-rhenius经验公式,活化能在65.4～81.2kJ/mol之间,温度稳定性相对常用的红曲红色素和甜菜苷色素为一般。pH对色素稳定性影响较小,pH1～10色调不发生变化,pH3～9色素最稳定。在太阳光曝晒下光稳定较差,室内散射光对色素的稳定性影响较小。急性毒性试验测得小鼠的LD_(50)>15000mg/kg,属于无毒级别。该色素可以作为天然食用色素资源开发利用。

关键词：南极地丝霉属 ITS序列天然色素稳定性

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极地真菌Geomyces pannorum SA3-2-YM次级代谢产物的研究

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天然产物研究与开发 2021年第1期33卷 48-56页

作者：周晓怡马钢华陈嘉颖李医明刘小宇张刘强上海中医药大学中药学院上海201203 海军特色医学研究中心海洋生物与极地医药研究室上海200433

采用聚酰胺柱层析、硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、凝胶柱层析和高效液相HPLC等色谱技术,对极地真菌Geomyces pannorum SA3-2-YM的发酵液提取物进行分离纯化,共得到13个化合物,通过NMR和MS等波谱数据确定结构为:cyclo-(L-Trp-L-Pro)(1)、... 详细信息

采用聚酰胺柱层析、硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、凝胶柱层析和高效液相HPLC等色谱技术,对极地真菌Geomyces pannorum SA3-2-YM的发酵液提取物进行分离纯化,共得到13个化合物,通过NMR和MS等波谱数据确定结构为:cyclo-(L-Trp-L-Pro)(1)、cyclo-(L-Trp-L-Tyr)(2)、cyclo-(Gly-L-Trp)(3)、cyclo-(L-Trp-L-Phe)(4)、cyclo-(L-Trp-L-Ser)(5)、cyclo-(L-Tyr-L-Pro)(6)、cyclo-(L-Trp-L-Ile)(7)、cyclo-(D-Ala-D-Trp)(8)、ergosterol(9)、(22E)-5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol(10)、anicequol(11)、indazole(12)、p-hydroxybenzaldehyde(13)。其中,化合物1~9、11~13均为首次从地丝霉属的真菌中分离得到。抑菌试验表明化合物9对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌具有一定的抑制活性,其最小抑制浓度(MIC)均为90μg/mL。采用CCK-8法测试了13个化合物对四种肿瘤细胞株的体外细胞毒活性,化合物1~13对四株实验肿瘤细胞株表现出不同程度的抑制活性,其中环二肽化合物8对HeLa肿瘤细胞的抑制率可达62.28%,含有过氧基团的化合物10对SMMC-7721细胞的抑制率达到了68.13%。

关键词：极地真菌地丝霉属次级代谢产物环二肽生物活性

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极地真菌Geomyces sp.3-1次级代谢产物的研究

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天然产物研究与开发 2017年第4期29卷 590-594页

作者：李云海王晓丽卢小玲于豪冰刘小宇第二军医大学海洋生物医药研究中心第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433 浙江海洋大学海洋科学与技术学院舟山316022

采用硅胶柱层析、ODS反相硅胶柱层析、凝胶柱层析和高效液相HPLC等色谱技术,对极地真菌Geomyces sp.3-1的发酵液提取物进行分离纯化,共得到8个化合物,通过波谱解析结合理化性质并比较相关文献,确定化合物为:paulownin(1)、demethylincis... 详细信息

采用硅胶柱层析、ODS反相硅胶柱层析、凝胶柱层析和高效液相HPLC等色谱技术,对极地真菌Geomyces sp.3-1的发酵液提取物进行分离纯化,共得到8个化合物,通过波谱解析结合理化性质并比较相关文献,确定化合物为:paulownin(1)、demethylincisterol A3(2)、ergosta-7,22-dienen-3,6-dione(3)、citreoanthrasteroid B(4)、19-norergosta-5,7,9,22-tetraene-3β-ol(5)、(22E)-5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol(6)、(3β,5α,6β,22E)-6-methoxyergosta-7,22-diene-3,5-diol(7)和ergosta-7,22-dien-3β-ol(8)。其中,化合物2~7均是首次从Geomyces属真菌中获得,化合物2有较好的抗菌和细胞毒活性。

关键词：极地真菌地丝霉属次级代谢产物生物学活性

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一株产红色素南极真菌的鉴定及其分泌色素的性质与结构研究

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一株产红色素南极真菌的鉴定及其分泌色素的性质与结构研究

作者：孙云飞河南农业大学

学位级别：硕士

随着合成色素负面报道的增多,其危害性已深入人心。天然色素安全可靠,着色自然,有些还兼具营养和保健功能,受到人们的欢迎,需求量激增。传统的天然色素大多来源于植物提取,受制于原料的供应,导致色素品质参差不齐,产量低,成本高,已经不... 详细信息

随着合成色素负面报道的增多,其危害性已深入人心。天然色素安全可靠,着色自然,有些还兼具营养和保健功能,受到人们的欢迎,需求量激增。传统的天然色素大多来源于植物提取,受制于原料的供应,导致色素品质参差不齐,产量低,成本高,已经不能满足食品工业高速发展的需求。寻找新的具有开发价值的天然色素受到研究人员的重视。本实验室在对南极微生物的筛选过程中,从南极样品中筛选到一株紫红色色素高产真菌菌株WNF-15A。南极地理位置特殊,气候环境严酷,是一个潜在微生物物种宝库,从中更容易发现新的活性物质。因此,本文的研究工作以此为基础,对该株真菌进行了深入的研究。通过形态观察和ITS序列的系统发育分析,鉴定WNF-15A属于嗜冷的地丝霉属(Geomyces),最适生长温度15-20℃。对产色素条件的初步研究显示,低温和低水平的氮源有利于色素的合成和积累,以1%葡萄糖和200g/L的土豆浸液配制发酵培养基,10℃摇瓶发酵,第6 d开始有红色物质分泌,14 d时达到高峰。通过比较7种大孔吸附树脂对色素的静态吸附量和静态解吸率,选出DPH-722型树脂用于色素提取,提取条件为:静态吸附色素液,将色素吸附饱和的树脂装柱,70%乙醇动态洗脱;获得色素的洗脱液经过真空冷冻干燥,得到色价达到144.05的色素固体粉末,色价提高了10.4倍;利用此法,A达到了24.58的1L发酵液可以获得1.71 g色素干粉。对色素性质的研究结果表明:该色素为胞外分泌水溶性红色素,不溶于乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂,酸性条件下溶解度降低,在533nm波长处有最大吸收峰;对其热降解动力学研究显示,其对热较稳定;适宜在pH3-9范围使用;该色素在室内散射光和避光条件下一样稳定,但不易置于太阳光直射环境;水分活度降低有利于其稳定性的提高;另外,色素对DPPH·和·OH两种自由基的有清除能力,具有一定抗氧化性;急性毒性试验结果显示,该色素的小鼠LD>15000 mg/kg,属于无毒级别。因此该色素可以作为食用色素开发利用。在对WNF-15A分泌色素的分离鉴定过程中发现该色素是几种红色物质的混合物,采用正反相硅胶层析及HPLC的分离纯化方法,已经分离到两个红色化合物,对其中的2-C-1-1组分的MS、H-NMR谱图分析,得出该化合物是分子量为480.4的多苯环的高共轭物质。

关键词：天然色素南极地丝霉属 ITS序列稳定性大孔吸附树脂色谱

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两株极地海洋真菌次级代谢产物的研究

两株极地海洋真菌次级代谢产物的研究

作者：李云海中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

地球的两极具有独特的气候及地理特征,赋予了极地微生物特殊的生物学特性[1]。极地微生物资源的开发和应用日益受到国内外科研人员的广泛关注。有关极地微生物的药用资源开发与活性化学成分研究,也引起了当下天然产物研究者的广泛兴趣[2... 详细信息

地球的两极具有独特的气候及地理特征,赋予了极地微生物特殊的生物学特性[1]。极地微生物资源的开发和应用日益受到国内外科研人员的广泛关注。有关极地微生物的药用资源开发与活性化学成分研究,也引起了当下天然产物研究者的广泛兴趣[2]。在前期研究中,本课题组从多株极地微生物样品中筛选了两株具有多种细胞毒活性的极地海洋真菌Aspergillus sp.S-3-62和Geomyces sp.3-1。基于此背景,本文展开了对这两株真菌的发酵产物的化学成分研究。首先对菌株Aspergillus sp.S-3-62进行了发酵培养基的初步优化。采用OSMAC策略,在相同的培养条件下,选取5种不同培养基,通过比较发酵终点p H值、菌丝体干重、发酵液的总提物重量、总提物组分分布(TLC和HPLC-UV)得出最佳发酵条件为:采用改良察氏液体培养基,温度24?C,接种量10%,转速120 r/min,振荡培养8 d。菌株Aspergillus sp.S-3-62按优化后的条件规模发酵350 L,发酵结束后将发酵液高速离心,分别获得菌丝体和菌液,菌液部分用等体积乙酸丁酯萃取3次,40℃减压浓缩后获得42 g浸膏;将菌丝体部分以1:5的比例浸泡于无水乙醇中,超声提取(40min/次,共两次),过滤,得上清液进行减压蒸馏,除去有机溶剂,加蒸馏水混悬,再用乙酸乙酯(体积比1:1)萃取3次,获得浸膏8 g。合并两部分浸膏,共获得粗提物浸膏约50 g。菌株Geomyces sp.3-1通过分批摇瓶发酵共获得发酵液42 L,采用同上方法分别将菌液和菌体用有机溶剂提取后再合并,共得到粗提物浸膏9.3 g。采用正相硅胶柱层析、C18反相硅胶柱层析、LH-20凝胶柱层析和高效液相HPLC等色谱技术,从两株极地真菌中获得单体化合物30余个。通过现代波谱分析手段,采用包括一维核磁共振(1D-NMR)、二维核磁共振(2D-NMR)以及高分辨质谱(HR-ESI-MS)等方法,并结合相关的文献数据报道,共鉴定了两株菌种共18个化合物的结构,他们分别为:β-carboline(1),N-(2-Hydroxypropanoyl)-2-aminobenzoic acid amide(2),Cyclo-(Pro-8-hydroxy-Ile)(3),Cyclo-(Pro-Ile)(4),2-Acetyl-4(3H)-quinazolinone(5),4-Hydroxybenzaldehyde(6),Benzeneacetic acid,2-hydroxy-1-methylpropyl ester(7),Palitantin A(8),Palitantin B(9),Palitantin(10),Paulownin(11),Demethylincisterol A3(12),Ergosta-7,22-dienen-3,6-dione(13),Citreoanthrasteroid B(14),19-Norergosta-5,7,9,22-tetraene-3β-ol(15),(22E)-5α,8α-Epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol(16),(3β,5α,6β,22E)-6-Methoxyergosta-7,22-diene-3,5-diol(17)和Ergosta-7,22-dien-3β-ol(18)。其中化合物8(Palitantin A)和9(Palitantin B)为新化合物,化合物7为首次从天然产物中分离得到,化合物12-17是首次报道的极地来源的地丝霉属真菌代谢产物。对这些化合物进行了一系列的生物学活性评价,其中包括肿瘤细胞毒活性、蛋白酪氨酸磷酸1B酶(Protein Tyrosine Phosphatase-1B,PTP-1B)抑制活性和抗菌活性研究。结果表明:化合物10、11和12有较强的PTP-1B抑制活性,IC50分别为23.74±0.43μM、34.32±0.28μM和17.24±0.28μM,稍弱于阳性对照(齐墩果酸的IC50为8.31±0.31μM)。化合物12有一定的抑制人胃癌细胞SGC-7901和人肝癌细胞SMMC-7721增殖的作用,IC50为13.94±0.33μM和11.40±0.41μM(紫杉醇的IC50分别为1.59±0.25μM和0.36±0.10μM);抗菌实验结果表明,化合物12对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和大肠杆菌(Escherichia coli),均有较强的抑制作用,最低抑制浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)分别为9.97μM、7

关键词：极地真菌地丝霉属曲霉属分离纯化结构鉴定生物学活性

南极真菌Geomyces sp．产色素条件和色素提取的研究

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海洋科学进展 2011年第A1期29卷 116-121页

作者：孙云飞臧家业张波涛王能飞河南农业大学生命科学学院河南郑州450002 国家海洋局第一海洋研究所山东青岛266061 青岛大学化工学院山东青岛266071

从南极土样中分离得到一株能大量分泌紫红色色素的地丝霉属（Geomyces）的真菌。通过对培养基和温度的选择，确定了该菌株产色素的基础培养基，发现较低的温度有利于色素的积累。另外，对7种树脂吸附量、解吸率和提取效率进行了比较，... 详细信息

从南极土样中分离得到一株能大量分泌紫红色色素的地丝霉属（Geomyces）的真菌。通过对培养基和温度的选择，确定了该菌株产色素的基础培养基，发现较低的温度有利于色素的积累。另外，对7种树脂吸附量、解吸率和提取效率进行了比较，选择了HPD-722型树脂吸附色素，洗脱剂为70％乙醇。经过大孔树脂吸附法提取，色素色价从12．68提高到144．05，增高10．4倍，效果非常明显。碳源的加入对电池阳极表面菌群的种类组成有较大的扰动，导致细菌种类多样性的降低，其中华丽杆菌（Chryseobacterium sp．）为易感种类。

关键词：南极地丝霉属天然色素大孔吸附树脂