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土壤宏基因组的提取及基于免培养技术分析细菌16S rDNA

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江西农业大学学报 2005年第4期27卷 505-507页

作者：方光伟洪雪梅蔡丽希彭锟林毅华侨大学生物工程与技术系福建泉州362021 华侨大学信息科学与工程学院福建泉州362021

采用CTAB-SDS-冻融法和玻璃粉吸附法提取土壤宏基因组(metagenome),经琼脂糖凝胶电泳后用回收试剂盒对其进行纯化。以细菌16SrDNA通用引物从宏基因组中扩增出V8和V9两个高变区,回收纯化后与克隆载体pMD18-T连接,转化大肠杆菌DH5α,随机... 详细信息

采用CTAB-SDS-冻融法和玻璃粉吸附法提取土壤宏基因组(metagenome),经琼脂糖凝胶电泳后用回收试剂盒对其进行纯化。以细菌16SrDNA通用引物从宏基因组中扩增出V8和V9两个高变区,回收纯化后与克隆载体pMD18-T连接,转化大肠杆菌DH5α,随机挑取一个阳性克隆菌进行序列测定,经BLAST分析表明该序列所代表的是一个不动杆菌属(Acinetobacter)细菌。本研究结果为分析土壤微生物种群结构和直接从土壤中分离功能基因奠定了基础。

关键词：土壤宏基因组提取 16S rDNA 免培养

利用土壤宏基因组技术定向筛选抗生素产生菌的方法学建立

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微生物学通报 2011年第7期38卷 1125-1130页

作者：栗若兰郑智慧路新华张华蒋沁华北制药集团新药研究开发中心微生物药物国家研究工程中心河北石家庄050015

为了快速从土壤中定向筛选抗生素产生菌,本研究利用宏基因组技术进行了土壤中抗生素产生菌快速筛选方法的探索。对6种不同土质的土壤利用液氮冷冻法提取土壤基因组DNA并用PVPP柱层析法进行纯化,每克湿土可得到32.25-61.25μg DNA,片段... 详细信息

为了快速从土壤中定向筛选抗生素产生菌,本研究利用宏基因组技术进行了土壤中抗生素产生菌快速筛选方法的探索。对6种不同土质的土壤利用液氮冷冻法提取土壤基因组DNA并用PVPP柱层析法进行纯化,每克湿土可得到32.25-61.25μg DNA,片段大小为23 kb左右,说明宏基因组DNA样品完整,16S rDNA的PCR结果证明了该基因组DNA纯度可用于后期的分子操作。利用Herbimycin产生菌掺入法进行了抗生素产生菌筛选方法学的验证。结果证明,每克湿土掺入103个Herbimycin产生菌时,利用Herbimycin合成基因簇的特定引物即可从所提取的土壤基因组DNA中扩增出目标条带,并且可以利用传统菌种分离方法从土壤中重新分离出来被掺入到土壤的Herbimycin产生菌。这些结果证明本研究建立的定向抗生素产生菌筛选方法,具有快捷、灵敏的特点,大大减少传统筛选方法的工作强度和时间,为微生物新药的研发建立一种全新的研究方法。

关键词：土壤宏基因组 DNA提取 DNA纯化基因筛选

来源于土壤宏基因组中漆酶Lac13H9基因克隆及其酶学性质分析

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中国农业科技导报 2015年第2期17卷 64-71页

作者：胡斌斌吴萍刘晓青丁伟伍宁丰甘肃农业大学生命科学技术学院兰州730070 中国农业科学院生物技术研究所北京100081

漆酶广泛存在于土壤中,在有机农药残留和木质素的降解方面具有潜在的工业价值。从土壤宏基因组中得到了一个全长为1 389 bp漆酶基因lac13H9,编码462个氨基酸,预测理论分子量为50 k Da,含有一个17个氨基酸组成的信号肽,与NCBI蛋白数据库... 详细信息

漆酶广泛存在于土壤中,在有机农药残留和木质素的降解方面具有潜在的工业价值。从土壤宏基因组中得到了一个全长为1 389 bp漆酶基因lac13H9,编码462个氨基酸,预测理论分子量为50 k Da,含有一个17个氨基酸组成的信号肽,与NCBI蛋白数据库比对结果表明是一个新的漆酶基因。将lac13H9转入到大肠杆菌Transseta(DE3)中通过微好氧发酵进行异源表达,并通过Ni柱亲和层析纯化。获得的重组漆酶Lac13H9具有良好的酶学性质,其最适温度为40℃,最适p H为6.0,且具有较好的热稳定性,在50℃下保温90 min还有60%的剩余酶活力,同时发现低浓度的Fe2+促进漆酶酶活,高浓度则抑制酶活。良好的酶学性质为该酶的应用奠定了基础。

关键词：土壤宏基因组漆酶基因克隆酶学性质

基于土壤宏基因组的新颖木聚糖酶基因克隆及生物信息学分析

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生物化工 2020年第1期6卷 49-54页

作者：魏琦超王亚丽张琛赵加迪河南科技学院生命科技学院

土壤微生物总DNA经试剂盒提取,使用CODEHOP引物进行木聚糖酶基因编码区核心序列进行扩增,根据所扩增序列设计hiTAIL-PCR特异性引物,最终克隆了1个编码区长度为1284 bp的新颖木聚糖酶基因。生物信息学分析表明,该基因编码蛋白质氨基酸序... 详细信息

土壤微生物总DNA经试剂盒提取,使用CODEHOP引物进行木聚糖酶基因编码区核心序列进行扩增,根据所扩增序列设计hiTAIL-PCR特异性引物,最终克隆了1个编码区长度为1284 bp的新颖木聚糖酶基因。生物信息学分析表明,该基因编码蛋白质氨基酸序列长度为427 aa,分子量为47398.91 Da,理论等电点(pI)为8.99,是一个不含跨膜区域的亲水性蛋白。

关键词：土壤宏基因组木聚糖酶基因克隆生物信息学分析

基于16SrDNA基因高通量测序分析植烟土壤的细菌群落结构

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分子植物育种 2018年第24期16卷 8022-8027页

作者：刘加红高华锋解燕马伟余磊孔垂思蔺忠龙杨涛云南省烟草公司曲靖市公司曲靖655000 云南省农业科学院农业环境资源研究所昆明650205 中国烟草总公司云南省公司昆明650011 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所昆明650205 云南省农业科学院昆明650205 昆明学院云南省都市特色农业工程技术研究中心昆明650214

钾是影响烤烟品质的重要元素之一,为研究不同烤烟品质植烟区土壤的细菌群落,以期为提高烤烟品质提供依据,本研究通过对采取烤烟高钾植烟区的土样、烤烟低钾植烟区的土样,并通过宏基因组16SrDNA基因高通量测序,分析不同植烟区土壤细菌的... 详细信息

钾是影响烤烟品质的重要元素之一,为研究不同烤烟品质植烟区土壤的细菌群落,以期为提高烤烟品质提供依据,本研究通过对采取烤烟高钾植烟区的土样、烤烟低钾植烟区的土样,并通过宏基因组16SrDNA基因高通量测序,分析不同植烟区土壤细菌的群落结构,结果表明,高钾地区获得较多的有效序列。Shannon指数及Simpson指数共同表明高钾地区土样具有的细菌群落多样性最高。ACE指数与Chao1指数具有相同的趋势,都表明高钾地区土样具有的细菌群落丰富度最高。不同土壤样品细菌属水平的聚类分析显示把低钾地区的样品聚在一起,这些样品菌群分布比较相似。功能基因预测分析研究表明,高钾地区样品具有最多功能基因数量。

关键词：土壤宏基因组 16SrDNA 植烟土壤细菌群落结构

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银杏叶和根酚酸物质对桃金娘的化感作用

银杏叶和根酚酸物质对桃金娘的化感作用

作者：黎舒福建农林大学

学位级别：硕士

银杏（Ginkgo bloba）是我国重要经济树种之一。福建省龙岩市长汀县策武镇银杏生态园种植银杏已有20年历史,生态园表层土质疏松,抗侵蚀性差,水土流失严重。桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）耐瘠薄,是荒山绿化和水土保持的先锋树种。为... 详细信息

银杏（Ginkgo bloba）是我国重要经济树种之一。福建省龙岩市长汀县策武镇银杏生态园种植银杏已有20年历史,生态园表层土质疏松,抗侵蚀性差,水土流失严重。桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）耐瘠薄,是荒山绿化和水土保持的先锋树种。为改善水土流失现状,目前已在该银杏林下套种桃金娘,并取得了较佳的水土流失治理效果,但银杏与桃金娘种间关系是否协调,至今尚未开展相关研究。本试验采用盆栽试验方法,以不同浓度银杏鲜叶和鲜根水浸提液、化感物质阿魏酸溶液以及蒸馏水（对照）处理桃金娘3个月后,分析其对桃金娘生长、叶绿素荧光、土壤酶活性以及土壤微生物群落、土壤宏基因组的影响,研究结果从化学生态角度评价银杏与桃金娘种间生化关系,为水土流失区营建种间生化关系协调的银杏复层林,提高银杏林的水土保持效果提供理论参考依据。研究结果主要如下:（1）银杏叶和根酚酸物质鉴定采用液相色谱—质谱联用仪,对银杏鲜叶、落叶和鲜根酚酸物质进行鉴定。在正离子模式中,鲜叶检测到酚酸物质有8种,落叶有8种,鲜根有11种;在负离子模式中,鲜叶检测到酚酸物质有9种,落叶有8种,鲜根有9种;银杏叶及根中检测到共有的酚酸物质有9种,分别为丁香酸、十七烷二烯银杏酸、白果酸、白果新酸、十七烷一烯银杏酸、氢化白果酸、儿茶素、阿魏酸、奎尼酸。银杏鲜叶和落叶中的酚酸物质种类和含量差异较小,银杏根与叶相比则差异较大。（2）银杏水浸提液对桃金娘叶片叶绿素荧光参数的影响随着银杏鲜叶和鲜根水浸提液浓度的增加,桃金娘叶片最小荧光变量Fo、最大荧光变量Fm、可变荧光Fv这3个指标均呈现出“低促高抑”现象,不同浓度处理的桃金娘叶Fo、最大光能转换效率Fv/Fm、PSⅡ潜在活性Fv/Fo差异显著。（3）银杏水浸提液对桃金娘根际土壤酶活性的影响随着银杏鲜叶和鲜根水浸提液浓度的升高,桃金娘根际土壤纤维素酶、蔗糖酶活性均呈增加趋势,蛋白酶、脲酶活性则表现为先降低后上升的趋势,多酚氧化酶、过氧化物酶活性呈逐渐降低趋势,酸性磷酸酶活性则表现为“W”型曲线。与银杏鲜叶处理相比,银杏根水浸提液对酶活性的影响较大。（4）银杏水浸提液对桃金娘根际土壤细菌群落结构的影响采用Hi Seq2500高通量测序平台,对银杏鲜叶和鲜根0.10 g·mL-1浓度及蒸馏水处理的桃金娘根际土壤样品扩增子细菌341F-806R区进行测序。不同处理鉴定出的细菌序列隶属于10个门,46个纲,73个目,104个科,98个属,27个种,主要分布于变形菌门,共有优势细菌6类,分别为伯克氏菌属、浮霉状菌属、慢生根瘤菌属、Acidibacter、出芽菌属、假单胞菌属。（5）银杏水浸提液对土壤真菌群落结构的影响采用Hi Seq2500高通量测序平台,对扩增子真菌ITS2区进行测序。不同处理鉴定出的真菌序列隶属于4个门,17个纲,39个目,65个科,86个属,49个种,主要分布于子囊菌门和担子菌门,共有优势真菌10类,分别是双足囊菌属、白地霉属、Saitozyma、枝孢菌属、鬼伞属、镰刀菌属、Serendipita、拟盘多毛孢属、斜盖伞属、散斑壳属。（6）阿魏酸溶液对土壤微生物群落结构的影响对阿魏酸溶液和蒸馏水处理土壤进行宏基因组检测,共检测到3个界,分别是细菌（数量占检测结果90%以上）、真菌和古菌。在阿魏酸处理鉴定到了 46个门,87个纲,209个目;在蒸馏水处理鉴定到了 46个门,85个纲,206个目。细菌门的测序结果显示,优势菌门分别为变形菌门、放线菌门和蓝藻细菌门;细菌属的测序结果显示,优势菌属分别为慢生根瘤菌属、节杆菌属、假单胞菌属、链霉菌属、伯克氏菌属。（7）阿魏酸溶液对eggNOG功能注释的影响eggNOG功能注释结果显示,阿魏酸溶液处理的土壤中关于防御机制、复制—重组—修复、能量转换、运输代谢基因数增加,表明土壤细胞受到外界环境的干扰,细胞自身防御和修复机制更加活跃,染色质结构与动力学、信号转导机制、细胞运动和细胞骨架功能注释的基因数减少,表明在阿魏酸溶液处理下,土壤细胞有一定程度破坏,细胞运动减缓,细胞活性降低。（8）阿魏酸溶液对KEGG注释差异基因的影响KEGG注释差异基因的结果显示,基因数主要富集在新陈代谢、遗传信息处理和环境信息处理方面。在A级分类的6大类生物代谢通路中,阿魏酸溶液处理的土壤基因数均高于蒸馏水组,即阿魏酸溶液增加了土壤生物基因组数据,生命活动过程发生了改变;在B级分类的43种子功能中检测到25种,其中23种子功能在阿魏酸溶液处理的土壤基因数高于蒸馏水组。（9）阿魏酸溶液对CAZy碳水化合物酶的影响CAZy碳水化合物酶数据库结果显示,阿魏酸溶液处理土壤中糖苷水解酶、糖基转移酶、多糖裂合酶、辅助氧化还原酶分别提高了4.83%、3.05%、3.51%、7.57%,蒸馏水处理土壤中碳水化合物酯酶、碳水化合物结合

关键词：银杏桃金娘酚酸物质化感作用土壤宏基因组