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因宁片对甲亢性肝损害模型大鼠肝功能和氧化应激的影响

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中药材 2011年第2期34卷 278-281页

作者：周静王成蹊侯连兵南方医科大学南方医院药学部广东广州510515

目的:研究因宁片对甲状腺激素诱发大鼠甲亢性肝损害的肝功能和氧化应激的影响。方法:SD大鼠给予L-甲状腺素钠灌胃30 d,制备甲亢性肝损害模型。大鼠造模后给予因宁片低、中、高剂量或甲亢灵灌胃治疗30 d后,处死收集血样和肝组织,采用放... 详细信息

目的:研究因宁片对甲状腺激素诱发大鼠甲亢性肝损害的肝功能和氧化应激的影响。方法:SD大鼠给予L-甲状腺素钠灌胃30 d,制备甲亢性肝损害模型。大鼠造模后给予因宁片低、中、高剂量或甲亢灵灌胃治疗30 d后,处死收集血样和肝组织,采用放射免疫法测定血清T3、T4含量,全自动生化仪检测AST、ALT水平,比色法测定肝组织匀浆SOD、MDA、GSH-Px、CAT、GSH值。结果:因宁片可以明显降低L-甲状腺素钠引起的大鼠血清甲状腺激素水平(T3、T4)升高,纠正肝功能(AST、ALT)异常,降低肝脏MDA含量,提高SOD、CAT、GSH-Px活性,升高GSH水平。结论:因宁片对甲状腺激素诱发的大鼠甲亢性肝损害有明显保护作用,其作用机制可能与降低甲状腺激素水平及抑制肝脏氧化应激有关。

关键词：因宁片甲状腺激素甲亢肝损害氧应激大鼠

因宁片减轻T_3诱导BRL肝细胞损害的体外实验研究

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中药材 2012年第1期35卷 119-122页

作者：周静王成蹊周涛潘弟仪侯连兵王伯阳南方医科大学南方医院药学部广东广州510515 内蒙古医学院基础医学院内蒙古呼和浩特010055

目的:观察因宁片对T3诱导的BRL肝细胞的增殖、肝功能和氧化应激的影响,为进一步阐明药物作用机制提供实验依据。方法:25只雌性SD大鼠,随机分为5组:空白血清对照组,因宁片低、中、高剂量组及甲亢灵组。大鼠灌服相应剂量的药物后,腹腔静... 详细信息

目的:观察因宁片对T3诱导的BRL肝细胞的增殖、肝功能和氧化应激的影响,为进一步阐明药物作用机制提供实验依据。方法:25只雌性SD大鼠,随机分为5组:空白血清对照组,因宁片低、中、高剂量组及甲亢灵组。大鼠灌服相应剂量的药物后,腹腔静脉采血,分离含药血清。建立肝细胞T3损害模型,在不同浓度因宁片药物血清作用下,应用MTT法测定药物作用后细胞存活率的变化,全自动生化分析仪测定培养上清液中AST、ALT的含量,分光光度法测定细胞内MDA、SOD。结果:随着因宁片血药浓度升高,T3损害后的BRL肝细胞存活率逐渐增加;因宁片能显著减少模型细胞ALT、AST的释放;模型组BRL的细胞混悬液中的MDA含量显著升高,SOD活性显著降低,因宁片能明显降低MDA含量,提高SOD活性。结论:因宁片的药物血清对T3诱导BRL肝细胞损害有保护作用,提高BRL肝细胞存活率,降低细胞培养上清液中转氨酶含量,减轻肝细胞氧化应激损害。

关键词：因宁片药物血清 T3 肝损害 BRL MTT 肝功能氧化应激

因宁片含药血清对T3诱导大鼠肝巨噬细胞NF-κB、IκB-α磷酸化的影响

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中药材 2019年第8期42卷 1911-1914页

作者：杨琴龙丽马利赖月花文牡侯连兵南方医科大学南方医院广东广州510515

目的:研究因宁片对体外T3诱导大鼠肝巨噬细胞(RHMa)NF-κB、IκB-α磷酸化水平的影响。方法:通过不同浓度的T3作用于RHMa 24、48 h,MTT法检测其增殖率,Western Blot检测p-NF-κB、p-IκB-α蛋白表达,确定最佳干预浓度和干预时间,选用T35... 详细信息

目的:研究因宁片对体外T3诱导大鼠肝巨噬细胞(RHMa)NF-κB、IκB-α磷酸化水平的影响。方法:通过不同浓度的T3作用于RHMa 24、48 h,MTT法检测其增殖率,Western Blot检测p-NF-κB、p-IκB-α蛋白表达,确定最佳干预浓度和干预时间,选用T3500 nmol/L刺激RHMa细胞24 h后,给予10%因宁片含药血清治疗24 h,检测RHMa细胞中p-NF-κB、p-IκB-α蛋白表达的变化。结果:RHMa的增殖率与T3的浓度呈负相关,p-NF-κB、p-IκB-α蛋白表达量随T3浓度的升高而升高。因宁片含药血清对p-NF-κB和p-IκB-α蛋白表达量的抑制作用呈剂量依赖性。结论:高浓度T3(≥300 nmol/L)对肝巨噬细胞均有直接的毒性作用,低浓度T3(≥50 nmol/L)即能诱导肝巨噬细胞中NF-κB、IκB-α的激活;而因宁片含药血清则能有效抑制肝巨噬细胞中NF-κB、IκB-α的磷酸化,这可能是因宁片治疗甲亢性肝损害的作用机制之一。

关键词： T3 肝巨噬细胞因宁片 p-NF-κB p-IκB-α

因宁片对甲亢性肝损害大鼠肝脏Fas、FasL、TNF-α表达的影响

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中国药房 2011年第7期22卷 597-599页

作者：周静王成蹊侯连兵南方医科大学南方医院药学部广州市510515

目的:研究因宁片对甲亢性肝损害大鼠肝脏脂肪酸合成酶(Fas)、Fas配体(FasL)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响。方法:采用L-甲状腺激素钠(800μg·kg-1)灌胃复制大鼠甲亢性肝损害模型。给予因宁片低、中、高(0.3、0.6、1.2g·kg-1)... 详细信息

目的:研究因宁片对甲亢性肝损害大鼠肝脏脂肪酸合成酶(Fas)、Fas配体(FasL)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响。方法:采用L-甲状腺激素钠(800μg·kg-1)灌胃复制大鼠甲亢性肝损害模型。给予因宁片低、中、高(0.3、0.6、1.2g·kg-1)剂量、甲亢灵(0.6g·kg-1),灌胃30d后处死大鼠,取肝脏。光镜下观察肝脏病理组织学改变,采用免疫组化技术观察各组大鼠肝脏中Fas、FasL、TNF-α的表达。结果:甲亢性肝损害大鼠肝脏中Fas、FasL、TNF-α表达显著增强,因宁片可下调模型大鼠肝脏中Fas、FasL、TNF-α水平,并改善肝脏组织病理学变化。结论:Fas、FasL、TNF-α在大鼠甲亢性肝损害中发挥重要作用,因宁片防治甲亢性肝损害的作用与抑制Fas、FasL、TNF-α表达和抑制细胞凋亡有关。

关键词：因宁片甲状腺功能亢进症肝损害脂肪酸合成酶脂肪酸合成酶配体肿瘤坏死因子-α

因宁片对甲状腺素诱导的甲亢阴虚型动物的药效学研究

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因宁片对甲状腺素诱导的甲亢阴虚型动物的药效学研究

作者：刘婷南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景甲状腺功能亢进症(简称甲亢)是临床常见的内分泌疾病。中医理论认为甲亢多属瘿病范畴。该病多因肝郁火伏,以致激动肝火,或情志内伤,肝气郁结而引发。其发病机理与经、孕、产、乳等生理功能失调及体质因素等有一定关系,体内阴... 详细信息

研究背景甲状腺功能亢进症(简称甲亢)是临床常见的内分泌疾病。中医理论认为甲亢多属瘿病范畴。该病多因肝郁火伏,以致激动肝火,或情志内伤,肝气郁结而引发。其发病机理与经、孕、产、乳等生理功能失调及体质因素等有一定关系,体内阴阳乘戾,气滞痰凝,壅结颈前功尽弃基本病变,若迁延日久,引起血脉瘀阻则由气、痰、瘀三者合而交结为患。本病初起多实,病久则由实转虚,或虚实夹杂。我们根据甲亢病的病理变化是以气为先,也就是由气滞、痰凝、血瘀、肝火、直到阴虚,而这一病理变化又涉及到肝、心、肾、脾等脏器,所以我们在治疗上从疏肝解郁、理气化痰、活血祛瘀的同时,注重滋阴养血和补益元气,调整机体的脏腑功能,恢复机体各个系统的正常功能,尤其是恢复机体的免疫功能,只有这样才能巩固疗效,标本兼治。甲亢病位在颈部,临床上呈现的颈肿、怕热汗出、心悸心烦、消谷善饥、性急易怒、指舌颤动、形体消瘦等症状,是一个多脏腑受病、多病机并存的复杂的病理过程,中医治疗上常通过疏肝理气、清肝泻火、健脾化痰、滋阴降火、滋补肝肾、宁心安神、祛痰散结、活血通络、驱除邪毒等多种方法、多个环节,借以达到调整人体内环境失调的病理状态。中药或西药治疗甲亢等甲状腺疾病各有优势,采取中西医结合为主的综合性治疗措施,已成为近年来临床研究的重要课题之一,从众多的中西医治疗措施中可以看出,中西医结合治疗甲状腺疾病是总的趋势,近10年来中医药治疗甲亢有了可喜的进展,辩证分型、治疗手段灵活多样,疗效肯定,尤其在改善症状,调节人体免疫机制、减少西药副作用方面显示出较大的优势,总结开发出了较多新的治疗方剂。中医辩证施治促进甲状腺功能的恢复,不仅为广大患者所接受,而且被众多病例证实,提高了临床疗效,方便了患者。甲亢的临床研究和科研实验,在深度和广度上均有所进展,今后需要结合免疫学、分子生物学、生物化学、基因遗传工程学等新技术、新方法,加强对甲亢药物有效成分、结构改造的研究,从中筛选出疗效较佳者用于临床治疗中,以期取得较好的疗效。因宁片为广州南方医院临床经验方,对阴虚型、痰湿型、血瘀型甲亢均具较好的临床疗效。本研究课题将结合药剂学、药理学、内分泌学、核医学、组织病理学、卫生统计学等学科的研究方法和技术,通过对因宁片的药效研究来达到临床安全治疗甲亢的目的,同时适应新药审批的需要。力求通过具体的系统的实验研究,对纯中药因宁片的药效进行评价。主要内容目的 1以灌胃甲状腺素混悬液的方法建立甲亢阴虚型大鼠模型,并比较不同性别大鼠造模的差异性。 2观察因宁片对甲亢阴虚型大鼠/小鼠的主要药效学作用,对甲亢阴虚型大鼠/小鼠血清值:三碘甲状腺原氨酸(T)、甲状腺素(T)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT)、游离甲状腺素(FT)、促甲状腺素(TSH)和动物外观行为、体重、肛温及组织脏器指数和病理变化进行计算检测和分析。 3对因宁片进行毒理学研究,观察1d内用最大剂量混悬液灌胃给小鼠后,所产生的急性毒性反应及死亡情况,为临床应用提供数据。方法 1甲亢阴虚型大鼠模型的建立取SD大鼠♀♂分开,分别随机分为4组,共8组,每组6只,第1组为生理盐水组,第2～4组为实验给药组(即甲状腺素生理盐水混悬液低、中、高剂量组)。除第1组ig给予等体积的生理盐水外,其它各组分别给予浓度为2.5 ***、5 ***、***的甲状腺素生理盐水混悬液,1次/d,连续给药30d后处死大鼠。观察造模后各组大鼠外观、行为、体重、肛温的变化,并对血清值T、T、FT、FT、TSH进行检测,同时比较♀♂大鼠造模的差异性。 2因宁片对甲亢阴虚型动物甲状腺功能、外观情况以及组织病理的影响取SD♀大鼠/小鼠48只,按空腹体重计算给药量,随机分为6组,每组8只,即:生理盐水组、甲亢模型组、甲亢灵组、因宁片低、中、高剂量组。除生理盐水组外,其余各组ig给药1次/d ***/***甲状腺素混悬液,连续30d进行甲亢阴虚型模型的制备,于造模第31d ig给药1次/d,甲亢灵组给予***/***甲亢灵片混悬液,因宁片低、中、高剂量组分别给予***、***、***/***、***、***的因宁片混悬液,模型对照组及生理盐水组给予等容量的生理盐水,连续给药治疗30d后处死大鼠/小鼠,用放免法和免放法检测各组大鼠/小鼠的血清T、T、FT、FT、TSH值,并观察体重、肛温及外观行为的变化,取甲状腺、肾上腺、肝脏组织称量,计算脏器指数,并通过病理切片来观察组织变化,检测白细胞、中性粒细胞总数。 3急性毒性实验给昆明种小鼠灌服因宁片配制成的最大浓度的混悬液,未测出LD,故作最大给药量测试。取昆明种小鼠♀♂各20只,按空腹体重计算给药量,依性别体重均分2组:正常对照组和给药组(因宁片组),给药组以将

关键词：甲状腺素甲亢阴虚型因宁片 T3 TSH 最大耐受量

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因宁片的质量标准研究

因宁片的质量标准研究

作者：齐菲第一军医大学

学位级别：硕士

目的：建立因宁片的定性与定量方法，为因宁片的质量控制提供可行、可靠的分析方法。方法：采用薄层色谱法对制剂中的黄芪、当归、昆明山海棠、五味子进行定性鉴别;采用高效液相色谱法对制剂中君药黄芪中的黄芪甲苷进行含量测定：... 详细信息

目的：建立因宁片的定性与定量方法，为因宁片的质量控制提供可行、可靠的分析方法。方法：采用薄层色谱法对制剂中的黄芪、当归、昆明山海棠、五味子进行定性鉴别;采用高效液相色谱法对制剂中君药黄芪中的黄芪甲苷进行含量测定：采用高效液相色谱法对君药昆明山海棠中的表-儿茶素进行含量测定;采用离子交换色谱法对制剂中氨基酸进行了初步的研究;并对该制剂进行了一般性检查。结果：定性鉴别中，黄芪、当归、昆明山海棠、五味子在供试品色谱中在与对照品相应的位置上有相同颜色的斑点，而阴性对照则无相同颜色的斑点，薄层色谱鉴别方法专属性强。在定量分析研究中，黄芪甲苷定量测定在0.6～7.5μg范围内有良好线性关系(r-0.9996)，平均回收率为98.0％，RSD为1.3％，并确定黄芪甲苷每片的含量不低于70μg;昆明山海棠中表-儿茶素含量测定在5～100μg／ml有良好线性关系(r=0.9997)，平均回收率为97.5％，RSD为1.3％，并确定表-儿茶素的含量不低于0.15mg;制剂中氨基酸含量高达38％。一般性检查中，崩解时限和片重差异均符合规定。结论：定性、定量方法简便、可靠、准确、专属性强，可用于制剂的质量控制。初步起草了因宁片的质量标准。

关键词：因宁片质量标准黄芪当归昆明山海棠五味子黄芪甲苷表-儿茶素薄层色谱法高效液相色谱法

因宁片的定性鉴别及其对甲亢伴肝损害大鼠药效学与作用机制研究

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因宁片的定性鉴别及其对甲亢伴肝损害大鼠药效学与作用机制研究

作者：吴江杰南方医科大学

学位级别：硕士

背景与目的甲亢伴肝损害是甲状腺功能亢进常见并发症之一,临床表现为肝功能异常、黄疸、肝脏肿大等症状。目前国内用药以抗甲状腺药(ATDs)为主,而ATDs治疗过程中会造成肝损害,因此,临床急需抗甲亢及护肝药物。因宁片是南方医科大学南方... 详细信息

背景与目的甲亢伴肝损害是甲状腺功能亢进常见并发症之一,临床表现为肝功能异常、黄疸、肝脏肿大等症状。目前国内用药以抗甲状腺药(ATDs)为主,而ATDs治疗过程中会造成肝损害,因此,临床急需抗甲亢及护肝药物。因宁片是南方医科大学南方医院院内制剂,在临床上作为治疗甲亢伴肝损害药物使用多年,疗效确切,具有很好的抗甲亢及护肝作用,发展潜力巨大。然而因宁片中君药昆明山海棠药材在中药复方制剂中的定性鉴别研究尚未完善且因宁片作用机制亦未完全清楚。本文采用薄层色谱(TLC)法对中药复方制剂因宁片中的昆明山海棠药材进行了定性鉴别研究同时以甲亢伴肝损害大鼠为研究对象,探讨因宁片对甲亢的药效及护肝作用机制。方法(1)制备因宁片供试品、阴性对照品及昆明山海棠对照药材溶液,照《中国药典》(2020版)TLC法(通则0502),吸取阴性对照品溶液10 μL、因宁片供试品溶液20 μL和昆明山海棠对照药材溶液1 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正己烷:乙酸乙酯(5:1)为展开剂,展开后取出晾干,紫外光366 nm下检视。(2)SD雌性大鼠60只,以L-甲状腺素(800μg/kg·d)制备甲亢模型,设置正常对照组、甲亢模型组、因宁片低剂量组(0.6 g/kg·d)、中剂量组(1.2 g/kg·d)、高剂量组(2.4g/kg·d)、阳性药抑亢丸组(1 g/kg ·d),每组10只,正常对照组灌胃等量生理盐水;造模21 d检测血清T3、T4、TSH,肝功能指标,检测甲亢模型是否制备成功;实验期间每日记录体重;实验结束后收集血清、肝脏及甲状腺;采用全自动生化仪检测肝功能指标;酶联免疫吸附法检测T3、T4及TSH水平;HE染色观查肝脏和甲状腺组织病理学变化;免疫组化检测Dio I在肝脏中的表达量变化;Western Blot检测肝脏组织内质网应激通路蛋白表达量变化;RT-PCR检测肝脏组织内质网应激通路RNA表达水平。(3)利用衣霉素激活HepG2细胞内质网应激信号通路,CCK-8法检测不同浓度因宁片浸膏(2.5、5、10mg/ml)和衣霉素(1、2、3、4、5 ug/ml)对HepG2细胞增殖率的影响,筛选最佳给药浓度;ROS试剂盒检测因宁片浸膏对HepG2细胞内ROS产生的影响;Western Blot检测内质网应激相蛋白的表达量;免疫荧光检测HepG2细胞内GRP78、Bax、Bcl-2蛋白荧光强度;流式细胞术检测因宁片浸膏对衣霉素诱导HepG2细胞凋亡的保护作用。结果(1)以正己烷:乙酸乙酯(5:1)为展开剂进行展开,色谱斑点居中,且色谱斑点清晰、分离度较好;系统耐用性试验表明:该方法对不同厂家薄层板、温度、湿度耐受性良好,达到鉴别因宁片中昆明山海棠预期目标。(2)造模第21 d,模型组大鼠T3、T4、AST、ALT、ALP水平明显升高。表明甲亢肝损伤大鼠模型制备成功。最后实验结果表明:因宁片能使大鼠体重增长恢复正常;降低血清T3、T4水平;降低肝功能ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL、IBIL水平;改善甲状腺滤泡细胞增生和细胞融合现象;减轻肝细胞肿胀症状,恢复肝索正常形态;降低内质网应激通路中GRP78、ATF6、PERK等蛋白表达量。(3)体外实验结果表明:因宁片浸膏能抑制衣霉素对HepG2细胞内质网应激信号通路激活,降低GRP78、ATF6、JNK等蛋白表达水平;降低HepG2细胞ROS水平;降低由于内质网应激通路激活造成的GRP78、Bax、Bcl-2荧光强度升高;抑制内质网应激通路激活造成的细胞凋亡。结论TLC法专属性强、操作简便,研究结果可为含有该药材的中药复方制剂产品质量标准研究提供参考与借鉴。因宁片能降低甲亢大鼠血清中T3和T4水平,降低肝功AST、ALT及ALP水平,改善甲亢大鼠甲状腺及肝脏病理损伤,降低肝脏组织DioI水平,对甲亢伴肝损害呈现良好的保护作用。因宁片可能通过抑制内质网应激通路的促凋亡,减少肝细胞凋亡,从而起到保护肝脏的效果。

关键词：因宁片定性鉴别甲亢伴肝损伤作用机制

因宁片的急性毒性和长期毒性实验及甲亢性肝损害的临床因素分析

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因宁片的急性毒性和长期毒性实验及甲亢性肝损害的临床因素分析

作者：周涛南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景甲状腺机能亢进症（Hyperthyroidism,简称甲亢）是由多种原因引起的体内甲状腺分泌激素过多所致的机体神经、心血管、消化等系统兴奋性增高和代谢亢进为主要表现的一组内分泌疾病的总称。常见临床症状为多食易饥、体重减轻... 详细信息

研究背景甲状腺机能亢进症（Hyperthyroidism,简称甲亢）是由多种原因引起的体内甲状腺分泌激素过多所致的机体神经、心血管、消化等系统兴奋性增高和代谢亢进为主要表现的一组内分泌疾病的总称。常见临床症状为多食易饥、体重减轻、乏力、心悸、心动过速、怕热、急躁、易激动,甲状腺常为弥漫性、对称性轻度至中度肿大,不少弥漫性甲状腺肿大患者常伴有不同程度的突眼症,重症患者未经适当治疗,又因感染、手术等各种应激而诱发甲状腺危象[1]。甲亢病因较为复杂,其确切发病机制尚未明确。中医将本病归于“瘿、瘿气”范畴。一般认为其发病原因首先在于患者素体阴亏,肾阴不足,阴虚阳亢,加上情志失调,变生阴虚火旺、气阴两虚、痰湿阻滞等病机,其病位涉及肝、肾、心、脾、肺,而以肝肾为主[引。甲亢常累及全身多系统、多器官,其中常见而又往往易被忽视的是肝脏损害。甲亢性肝损害的发病率高达37%～76.7%[3-5],相当多的甲亢患者伴有肝脏损害,引起肝功能异常、肝肿大,黄疸等。目前国内外西医治疗本病：以抗甲状腺药物、放射性131I、手术切除等疗法为主,均不能纠正免疫功能紊乱,都存在一定的局限性和不同的副作用。西药抗甲亢药物治疗虽有效,但疗程较长,停药后复发率高达50%-80%,甲状腺肿、突眼等症状不易控制,而且副作用较大,患者可出现过敏反应（如皮肤瘙痒、皮疹、发热等,约占1%-5%）、骨髓影响（白细胞减少、血小板减少、贫血等,1%左右）[6]及肝功能损害、关节痛、水肿、脱发等。手术治疗有一定的适应症和禁忌症,且易损伤甲状旁腺和喉返神经[7]。近10年来中医药治疗甲亢取得可喜的进展,辨证分型、治疗手段灵活多样,疗效肯定,尤其对因白细胞减少或肝损害而不能耐受西药治疗者,中药治疗更突显了其独有的优势与特色。因宁片为广州南方医院临床经验方,它是以中医理论为依据,借助现代科技,从药理学、病理学等多学科角度入手,筛选了上百种中草药,最终由黄芪、昆明山海棠、鳖甲、当归、生地、甘草等九味中药科学配伍研制而成,诸药相和,共奏养阴软坚,解毒散结之功。经临床观察表明：因宁片对阴虚型、痰湿型、血瘀型甲亢均具有较好的临床疗效,可以有效消除甲亢症状,快速修复机体各个系统的正常功能,全面提高自身的免疫功能,达到标本兼治的目的。而且初步试验显示：因宁片对肝脏具有保护作用,避免了甲亢本身以及抗甲状腺药物引起的肝损害,填补了抗甲亢药物防肝损害治疗的用药空白。本课题将结合毒理学、药理学、动物实验方法学和生物统计学等学科的研究方法和技术,进行因宁片的急性毒性和长期毒性实验研究,并通过回顾性分析临床甲亢病历资料,对甲亢性肝损害的临床相关因素进行分析,最终为因宁片的新药研发和临床甲亢的治疗提供实验依据。目的通过急性毒性实验,考察因宁片对小鼠的急性毒性,测出半数致死量（LD50）或最大耐受量（MTD）;通过长期毒性实验,考察因宁片对大鼠的长期毒性,观察因宁片口服灌胃后动物出现的毒性反应及蓄积中毒的症状和靶器官;对因宁片毒性反应的危害程度进行安全性评价,为拟开发因宁片成为抗甲亢新药而提供临床用药剂量的安全范围;对甲亢性肝损害的临床因素进行分析,为甲亢性肝损害的诊治提供依据。方法 1.因宁片的急性毒性实验 40只KM小鼠按编号及体重分层数字随机分为2组,即空白对照组、因宁片组（32g·kg-1）,每组20只,雌雄各半,24h内2次灌胃给予纯净水及因宁片药液,2次给药间隔为6h。给药间隔期间连续观察小鼠的反应,之后每天上下午各观察1次,给药后连续观察14d,每天记录动物的一般状况,包括外观、行为、分泌物、排泄物、死亡情况及中毒反应（中毒反应的症状、严重程度、起始时间、持续时间、是否可逆）等,并记录体重和摄食量,实验结束后大体解剖小鼠,肉眼观察各脏器的病变情况。 2.因宁片的长期毒性实验将48只SD大鼠按长期毒性实验分组方法随机分为4组,即空白对照组、因宁片低剂量组（0.6g·kg-1）、中剂量组（3g-kg-1）、高剂量组（6g·kg-1）,每组12只,雌雄各半,各给药组分别相当于临床人日用剂量（0.06g·kg-1）的10倍、50倍和100倍;空白对照组给予等体积的纯净水。连续灌胃30d,给药期间大鼠自由摄食和饮水。每天观察记录大鼠的一般状况如进食、行为活动、粪便等。每周称体重和摄食量,并根据体重变化及时调整给药剂量。第30d给药24h后,用3%戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠,腹主动脉采血,采集的血样于血细胞分析仪上检测红细胞（RBC）、白细胞（WBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）、淋巴细胞（LY）等血液学指标。另外取血分离血清,于生化自动分析仪上测定血清中的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、胆红素（BIL）、总蛋白（TP

关键词：因宁片急性毒性长期毒性甲亢性肝损害

因宁片对L-甲状腺素诱导的甲亢伴肝损害大鼠的药效学及保护作用研究

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因宁片对L-甲状腺素诱导的甲亢伴肝损害大鼠的药效学及保护作用研...

作者：杨琴南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景与目的:甲亢性肝损害是甲亢的常见并发症之一,临床上主要表现为肝脏功能异常、黄疸、肝脏肿大等,肝脏组织病理学检测可发现肝细胞空泡化、球囊变性、单核细胞浸润、胆汁淤积以及肝脏巨噬细胞转移等特征。目前,针对甲亢病人来说... 详细信息

研究背景与目的:甲亢性肝损害是甲亢的常见并发症之一,临床上主要表现为肝脏功能异常、黄疸、肝脏肿大等,肝脏组织病理学检测可发现肝细胞空泡化、球囊变性、单核细胞浸润、胆汁淤积以及肝脏巨噬细胞转移等特征。目前,针对甲亢病人来说主要以抗甲状腺药物（ATDs）为首选疗法,然而,长期使用ATDs也容易导致肝损伤,增加患者肝脏负担。中药用于治疗肝损伤具有广阔的前景,许多中药材均有抗氧化应激、抗炎及抗凋亡等功效。目前市场上治疗甲亢合并肝损害的中成药几近空白。因宁片作为南方医科大学南方医院院内制剂,临床上主要用于甲亢疾病的治疗。因宁片含黄芪、麦冬、生地、五味子、甘草等中药组分,它们均具有良好的护肝作用。本课题旨在利用甲亢伴肝损害大鼠模型,探讨因宁片治疗甲亢伴肝损伤的药效学及其护肝的药物作用机制。方法:1.72只雌性SD大鼠分为正常对照组（11）只和模型组（61只）,模型组连续灌胃1000μg/kg·d L-甲状腺素,30d后检测血清三碘甲状腺原氨酸（T3）,谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平,各组随机抽取1只处死取肝脏做病理组织检查,以观察甲亢伴肝损害模型是否制备成功。随后将模型组分为6组,每组10只,分别为:甲亢组、因宁片低、中、高剂量组、抑亢丸组、丙硫氧嘧啶组。甲亢组与药物治疗组除继续灌胃L-甲状腺素,药物治疗组还分别灌胃因宁片0.6、1.2、2.4g/kg·d,抑亢丸1.0g/kg·d,丙硫氧嘧啶9.0mg/kg·d。正常对照组灌胃等量的生理盐水或蒸馏水。实验期间每日记录体重。实验结束时,收集全血后处死大鼠,立即摘取甲状腺和肝脏组织,称重,保存备用。2.通过不同浓度的T3作用于大鼠肝巨噬细胞（RHMa）24h、48h,MTT法检测其增殖率及Western Blot检测p-NF-κB和p-IκB-α蛋白的表达量。确定最佳干预浓度和干预时间后,选用T3 500nM刺激RHMa细胞24h后,给予10%因宁片药物血清治疗24h,检测RHMa细胞中p-NF-κB和p-IκB-α蛋白表达量的变化。结果:1.连续灌胃L-甲状腺素30d后,模型组大鼠T3、ALT、AST水平明显升高,肝脏组织病理切片显示:肝索排列紊乱、肝小叶不清晰、肝细胞出现脂肪浸润。表明甲亢性肝损伤大鼠模型制备成功。2.因宁片治疗后,与甲亢组大鼠比较,大鼠体重以及体重增加量显著性升高,肝脏脏器系数明显降低,甲状腺脏器系数升高。因宁片治疗组血清T3水平显著性降低,四碘甲状腺原氨酸（T4）和促甲状腺激素（TSH）水平轻度升高。因宁片对ALT、AST、碱性磷酸酶（ALP）有显著降低作用。因宁片能降低总蛋白（TP）、球蛋白（GLB）水平,但对胆红素水平几乎无影响。与甲亢组比较,因宁片治疗组甲状腺滤泡细胞增生和细胞融合现象减少;肝细胞肿胀症状减轻,肝细胞内无脂滴,肝索形态基本恢复正常。3.线粒体凋亡通路结果显示,因宁片实验组与甲亢组比较,肝脏中线粒体细胞色素c（Cyt c）表达量升高,胞浆Cytc表达量降低,Bcl-2、半胱天冬酶-3（caspase3）、caspase9 的表达量升高,Bax、切割式 caspase3（cleaved caspase3）、cleaved caspase9蛋白的表达降低。促进caspase3活化的caspase8蛋白表达水平提高。***1基因及肝脏氧化应激信号通路结果显示,因宁片治疗后,与甲亢组比较,Ⅰ型脱碘酶（DIO1）mRNA水平与甲亢组相比显著性降低。因宁片各剂量组细胞核和胞浆中的核因子NF-E2相关因子2（Nrf2）蛋白表达量升高,Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）的表达被抑制,醌氧化还原酶1（NQO1）、血红素氧合酶1（HO1）蛋白的表达水平升高。其mRNA与蛋白表达水平趋势基本相一致。其次,因宁片可降低丙二醛（MDA）水平,提高总抗氧化能力（TAC）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GSH-PX）酶活性;明显降低Ca2+-ATP酶活性,提高Na+-K+-ATP酶活性。***的增殖率与T3的浓度呈负相关;p-NF-κB和p-IκB-α蛋白表达量随T3浓度的增大而增高。因宁片对p-NF-κB和p-IκB-α蛋白表达量的抑制作用呈剂量依赖性关系。结论:因宁片能有效降低甲亢大鼠血清中的T3和转氨酶水平,改善甲亢大鼠甲状腺及肝脏病理损伤,对甲亢导致的肝损伤呈现良好的保护作用。其可能的作用机制可能包含以下4个方面:1.因宁片可有效抑制线粒体凋亡通路的促凋亡作用,减少肝细胞凋亡;2.降低DIO1酶活性,抑制甲状腺激素转化为有生物活性的T3;3.激活Nrf2信号通路,提高抗氧化酶活性,降低肝脏氧化应激水平;4.细胞实验表明,因宁片能有效抑制肝巨噬细胞中NF-κB和IκB-α的磷酸化。

关键词：因宁片甲亢伴肝损伤药效学作用机制