因宁片对L-甲状腺素诱导的甲亢伴肝损害大鼠的药效学及保护作用研究
作者单位：南方医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：侯连兵
授予年度：2019年
学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学]
摘 要：研究背景与目的:甲亢性肝损害是甲亢的常见并发症之一,临床上主要表现为肝脏功能异常、黄疸、肝脏肿大等,肝脏组织病理学检测可发现肝细胞空泡化、球囊变性、单核细胞浸润、胆汁淤积以及肝脏巨噬细胞转移等特征。目前,针对甲亢病人来说主要以抗甲状腺药物（ATDs）为首选疗法,然而,长期使用ATDs也容易导致肝损伤,增加患者肝脏负担。中药用于治疗肝损伤具有广阔的前景,许多中药材均有抗氧化应激、抗炎及抗凋亡等功效。目前市场上治疗甲亢合并肝损害的中成药几近空白。因宁片作为南方医科大学南方医院院内制剂,临床上主要用于甲亢疾病的治疗。因宁片含黄芪、麦冬、生地、五味子、甘草等中药组分,它们均具有良好的护肝作用。本课题旨在利用甲亢伴肝损害大鼠模型,探讨因宁片治疗甲亢伴肝损伤的药效学及其护肝的药物作用机制。方法:1.72只雌性SD大鼠分为正常对照组（11）只和模型组（61只）,模型组连续灌胃1000μg/kg·d L-甲状腺素,30d后检测血清三碘甲状腺原氨酸（T3）,谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平,各组随机抽取1只处死取肝脏做病理组织检查,以观察甲亢伴肝损害模型是否制备成功。随后将模型组分为6组,每组10只,分别为:甲亢组、因宁片低、中、高剂量组、抑亢丸组、丙硫氧嘧啶组。甲亢组与药物治疗组除继续灌胃L-甲状腺素,药物治疗组还分别灌胃因宁片0.6、1.2、2.4g/kg·d,抑亢丸1.0g/kg·d,丙硫氧嘧啶9.0mg/kg·d。正常对照组灌胃等量的生理盐水或蒸馏水。实验期间每日记录体重。实验结束时,收集全血后处死大鼠,立即摘取甲状腺和肝脏组织,称重,保存备用。2.通过不同浓度的T3作用于大鼠肝巨噬细胞（RHMa）24h、48h,MTT法检测其增殖率及Western Blot检测p-NF-κB和p-IκB-α蛋白的表达量。确定最佳干预浓度和干预时间后,选用T3 500nM刺激RHMa细胞24h后,给予10%因宁片药物血清治疗24h,检测RHMa细胞中p-NF-κB和p-IκB-α蛋白表达量的变化。结果:1.连续灌胃L-甲状腺素30d后,模型组大鼠T3、ALT、AST水平明显升高,肝脏组织病理切片显示:肝索排列紊乱、肝小叶不清晰、肝细胞出现脂肪浸润。表明甲亢性肝损伤大鼠模型制备成功。2.因宁片治疗后,与甲亢组大鼠比较,大鼠体重以及体重增加量显著性升高,肝脏脏器系数明显降低,甲状腺脏器系数升高。因宁片治疗组血清T3水平显著性降低,四碘甲状腺原氨酸（T4）和促甲状腺激素（TSH）水平轻度升高。因宁片对ALT、AST、碱性磷酸酶（ALP）有显著降低作用。因宁片能降低总蛋白（TP）、球蛋白（GLB）水平,但对胆红素水平几乎无影响。与甲亢组比较,因宁片治疗组甲状腺滤泡细胞增生和细胞融合现象减少;肝细胞肿胀症状减轻,肝细胞内无脂滴,肝索形态基本恢复正常。3.线粒体凋亡通路结果显示,因宁片实验组与甲亢组比较,肝脏中线粒体细胞色素c（Cyt c）表达量升高,胞浆Cytc表达量降低,Bcl-2、半胱天冬酶-3（caspase3）、caspase9 的表达量升高,Bax、切割式 caspase3（cleaved caspase3）、cleaved caspase9蛋白的表达降低。促进caspase3活化的caspase8蛋白表达水平提高。***1基因及肝脏氧化应激信号通路结果显示,因宁片治疗后,与甲亢组比较,Ⅰ型脱碘酶（DIO1）mRNA水平与甲亢组相比显著性降低。因宁片各剂量组细胞核和胞浆中的核因子NF-E2相关因子2（Nrf2）蛋白表达量升高,Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）的表达被抑制,醌氧化还原酶1（NQO1）、血红素氧合酶1（HO1）蛋白的表达水平升高。其mRNA与蛋白表达水平趋势基本相一致。其次,因宁片可降低丙二醛（MDA）水平,提高总抗氧化能力（TAC）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GSH-PX）酶活性;明显降低Ca2+-ATP酶活性,提高Na+-K+-ATP酶活性。***的增殖率与T3的浓度呈负相关;p-NF-κB和p-IκB-α蛋白表达量随T3浓度的增大而增高。因宁片对p-NF-κB和p-IκB-α蛋白表达量的抑制作用呈剂量依赖性关系。结论:因宁片能有效降低甲亢大鼠血清中的T3和转氨酶水平,改善甲亢大鼠甲状腺及肝脏病理损伤,对甲亢导致的肝损伤呈现良好的保护作用。其可能的作用机制可能包含以下4个方面:1.因宁片可有效抑制线粒体凋亡通路的促凋亡作用,减少肝细胞凋亡;2.降低DIO1酶活性,抑制甲状腺激素转化为有生物活性的T3;3.激活Nrf2信号通路,提高抗氧化酶活性,降低肝脏氧化应激水平;4.细胞实验表明,因宁片能有效抑制肝巨噬细胞中NF-κB和IκB-α的磷酸化。
同方学位论文库