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同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的四重实时荧光rt-pcr方法的建立及应用

中国兽医学报 2023年第3期43卷 448-454,461页

作者：高艺祥王金凤张倩孙晓霞刘立兵顾文源马宏伟韩庆安马增军王建昌石家庄海关技术中心河北石家庄050051 河北科技师范学院动物科技学院河北省预防兽医学重点实验室河北秦皇岛066004 河北省动物疫病预防控制中心河北石家庄050035

为实现对猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、猪传染性胃肠炎(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)和猪流性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的同时鉴别检测,根据PDCoV M基因、TGEV S基因、PoRV VP6基因和TGEV N基因保守区域序列合成特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了一种可同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的实时荧光rt-pcr方法。结果显示,所建立的四重实时荧光rt-pcr方法仅对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV出现阳性扩增,与PRV、PPV、PRRSV、CSFV、PCV2等猪常见病原无交叉反应;对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的最低检出限分别为1.17×10^(3),1.13×10^(3),1.31×10^(2)和1.18×10^(2)拷贝;重复性好,组内和组间试验变异系数均小于4.5%。进一步应用所建立的同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的实时荧光rt-pcr方法对199份采集自河北省不同地区腹泻猪的临床样品进行检测,结果检出23份PoRV阳性(11.56%)、12份PEDV阳性(6.03%)和1份TGEV阳性(0.50%),均为单一感染;未检出PDCoV阳性。本研究所建立的四重实时荧光rt-pcr检测方法可实现对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的同时鉴别检测,为实验室快速鉴别诊断猪病毒性腹泻提供了有效的技术支持。

关键词：猪德尔塔冠状病毒猪传染性胃肠炎猪轮状病毒猪流性腹泻病毒四重实时荧光rt-pcr

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禽偏肺病毒四重实时荧光rt-pcr检测方法的建立与应用

禽偏肺病毒四重实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

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作者：姜楠延边大学

学位级别：硕士

禽偏肺病毒主要引起火鸡和鸡发生急性高度接触性上呼吸道传染病。根据编码附属糖蛋白G基因的不同,禽偏肺病毒分为A、B、C和D四个亚型。火鸡是该病毒的易感动物,任何年龄都可发生呼吸道感染,日龄大的禽类较为严重。本病容易诱发其他细菌... 详细信息

禽偏肺病毒主要引起火鸡和鸡发生急性高度接触性上呼吸道传染病。根据编码附属糖蛋白G基因的不同,禽偏肺病毒分为A、B、C和D四个亚型。火鸡是该病毒的易感动物,任何年龄都可发生呼吸道感染,日龄大的禽类较为严重。本病容易诱发其他细菌疾病的发生,易形成混合感染,导致死亡率上升。种火鸡和种鸭感染禽偏肺病毒可以造成产蛋性能严重下降,给养禽业造成严重经济损失。目前,除澳大利亚以外,该病已在世界范围内广泛流行。为明确禽偏肺病毒对国内家禽的影响及提高我国禽偏肺病毒检测水平,缩短检测时间,简化实验操作程序,满足疫病快速初筛及快速检测需求,本研究建立了能够同时检测四种亚型禽偏肺病毒的实时荧光rt-pcr检测方法,并采集1920份禽类双拭子进行核酸检测,分析禽偏肺病毒在禽群中的分布规律。本研究分别针对A、B、D三个亚型禽偏肺病毒的G基因和C亚型禽偏肺病毒的M基因的保守区域设计4对引物及4条特异性TaqMan探针,建立禽偏肺病毒四重实时荧光rt-pcr检测方法,对所建立的检测方法进行敏感性和特异性评估。同时,从8个省份/直辖市的活禽交易市场采集1920份禽双拭子样品,提取样品中的病毒RNA,利用已建立的禽偏肺病毒四重实时荧光rt-pcr方法进行检测。为了保证检测方法的准确性,通过文献查找已发布的禽偏肺病毒常规rt-pcr检测方法进行验证。结果表明,用本试验筛选的引物和探针建立的禽偏肺病毒四重实时荧光rt-pcr方法检测,将检测模板10倍梯度稀释,A、B和C亚型禽偏肺病毒可以检测到正常扩增曲线的最低模板浓度为102copies/μL,D亚型禽偏肺病毒可以检测到正常扩增曲线的最低模板浓度为103copies/μL,具有较高的灵敏度;取各亚型禽流感病毒和我国流行的其他禽类常见呼吸道病毒进行实时荧光rt-pcr方法检测,结果显示各亚型禽流感病毒和其他禽类常见呼吸道病毒及阴性对照均未出现扩增曲线,具有较高的特异性。在1920份双拭子样品中检测出39份双拭子样品为禽偏肺病毒阳性。其中B亚型禽偏肺病毒32份,感染宿主全部为鸡;C亚型禽偏肺病毒5份,A亚型和C亚型混合感染禽偏肺病毒2份,感染宿主为鸭和鹅。利用已发表的禽偏肺病毒常规rt-pcr检测方法进行验证,均可以扩出正确的目的条带;将rt-pcr产物进行测序,测序结果在NCBI上进行BLAST比对分析,所得结果与建立的检测方法结果一致。两种方法的检测结果符合率为100%。本研究建立的禽偏肺病毒四重实时荧光rt-pcr检测方法,具有良好的特异性和敏感性,可以用于禽偏肺病毒的快速检测同时区分四个亚型,大大提高了检测效率。本研究对8个省/直辖市的1920份拭子样品检测结果表明,我国部分鸡、鸭和鹅存在带毒现象,初步分析了我国部分地区禽群中禽偏肺病毒的分布规律,为下一步检测其他地区禽群中的禽偏肺病毒提供方向,为我国禽偏肺病毒的防治提供正确的理论依据。

关键词：禽偏肺病毒 rt-pcr 四重实时荧光rt-pcr 快速检测

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猪常见重要病原多重实时荧光pcr鉴别检测方法的建立及应用

猪常见重要病原多重实时荧光PCR鉴别检测方法的建立及应用

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作者：高艺祥河北科技师范学院

学位级别：硕士

猪圆环病毒病、猪病毒性腹泻和猪水泡性疫病是严重影响我国养猪业健康发展的重要疫病。由于猪圆环病毒、猪腹泻病毒和猪水泡性病毒三组病原引起的疫病其临床症状极其相似,不易于区分各个病原,因此,就需要采用实验室检测方法实现鉴别诊... 详细信息

猪圆环病毒病、猪病毒性腹泻和猪水泡性疫病是严重影响我国养猪业健康发展的重要疫病。由于猪圆环病毒、猪腹泻病毒和猪水泡性病毒三组病原引起的疫病其临床症状极其相似,不易于区分各个病原,因此,就需要采用实验室检测方法实现鉴别诊断。本研究针对猪圆环病毒病、猪腹泻和猪水泡性疫病常见病原,建立了同时检测3种或者4种病原的多重实时荧光pcr鉴别检测方法,并对河北省猪群中部分猪轮状病毒流行毒株进行了遗传进化分析。1.为实现同时鉴别检测PCV2、PCV3、PCV4,本研究针对PCV2 Rep基因、PCV3 Cap基因、PCV4 Cap基因合成特异性引物和Taq Man探针,经过反应体系和条件的优化,建立了一种可以同时快速高效鉴别检测PCV2、PCV3和PCV4的三重实时荧光pcr方法。结果表明,该方法仅对PCV2、PCV3和PCV4出现阳性扩增,与PRV、PPV、PRRSV、CSFV、***、PEDV和TGEV等其他猪常见病原无交叉反应;对PCV2、PCV3和PCV4的最低检出限分别为1.69×10copies、1.38×10copies和1.42×10copies;重复性好,稳定性强。并对363份来自河北省不同地区养殖场、屠宰场和无害化处理厂的猪临床组织样品进行检测,结果显示PCV2、PCV3、PCV4的阳性率分别为50.69%(184/363)、17.91%(65/363)和5.78%(21/363),其中有3份PCV2/PCV3/PCV4共感染(占0.83%)。2.为实现PDCoV、TGEV、PoRV、PEDV的同时鉴别检测,根据PDCoV M基因、TGEV S基因、PoRV VP6基因和TGEV N基因保守区域序列合成特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了PDCo V、TGEV、PoRV和PEDV的四重实时荧光rt-pcr方法。结果显示该方法仅对PDCo V、TGEV、Po RV和PEDV出现阳性扩增,与PRV、PPV、PRRSV、CSFV、PCV2等其他猪常见病原无交叉反应;对PDCo V、TGEV、Po RV和PEDV的最低检出限分别为1.17×10copies、1.13×10copies、1.31×10copies、1.18×10copies;重复性好,组内和组间试验变异系数均小于4.5%。并对199份采集自河北省不同地区腹泻猪的临床样品进行检测,结果显示Po RV、PEDV和TGEV的阳性率分别为11.56%(23/199)、6.03%(12/199)和0.50%(1/199),未检出PDCo V。3.为实现对FMDV、VSV、SVDV、SVA的同时鉴别检测,根据FMDV 3D基因、VSV N基因、SVDV VP1基因和SVA 3D基因保守区域序列合成特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了FMDV、VSV、SVDV、SVA的四重实时荧光rt-pcr方法。结果显示,该方法仅对FMDV、VSV、SVDV和SVA出现阳性扩增,与PRV、PPV、PRRSV、CSFV、PCV2等其他猪常见病原无交叉反应;对FMDV、VSV、SVDV和SVA的最低检出限分别为1.45×10copies、1.32×10copies、1.30×10copies、1.04×10copies;重复性好,组内和组间试验变异系数均小于6.0%。并对220份来自河北省不同地区病死猪的组织样品进行检测,结果均为阴性。4.对PoRV部分阳性样品进行VP6基因的扩增、测序后获得2株PoRV VP6基因。同源性分析表明,2株河北省Po RV VP6流行株间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.4%和96.2%,与A群猪轮状病毒处于同一分支上,都属于A群亚群Ι型。

关键词：猪圆环病毒猪腹泻病毒猪水泡性病毒三重实时荧光pcr 四重实时荧光rt-pcr 遗传进化分析

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