禽偏肺病毒四重实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

作     者：姜楠 

作者单位：延边大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙福亮;王楷宬;王素春

授予年度：2020年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：禽偏肺病毒 RT-PCR 四重实时荧光RT-PCR 快速检测 

摘      要：禽偏肺病毒主要引起火鸡和鸡发生急性高度接触性上呼吸道传染病。根据编码附属糖蛋白G基因的不同,禽偏肺病毒分为A、B、C和D四个亚型。火鸡是该病毒的易感动物,任何年龄都可发生呼吸道感染,日龄大的禽类较为严重。本病容易诱发其他细菌疾病的发生,易形成混合感染,导致死亡率上升。种火鸡和种鸭感染禽偏肺病毒可以造成产蛋性能严重下降,给养禽业造成严重经济损失。目前,除澳大利亚以外,该病已在世界范围内广泛流行。为明确禽偏肺病毒对国内家禽的影响及提高我国禽偏肺病毒检测水平,缩短检测时间,简化实验操作程序,满足疫病快速初筛及快速检测需求,本研究建立了能够同时检测四种亚型禽偏肺病毒的实时荧光RT-PCR检测方法,并采集1920份禽类双拭子进行核酸检测,分析禽偏肺病毒在禽群中的分布规律。本研究分别针对A、B、D三个亚型禽偏肺病毒的G基因和C亚型禽偏肺病毒的M基因的保守区域设计4对引物及4条特异性TaqMan探针,建立禽偏肺病毒四重实时荧光RT-PCR检测方法,对所建立的检测方法进行敏感性和特异性评估。同时,从8个省份/直辖市的活禽交易市场采集1920份禽双拭子样品,提取样品中的病毒RNA,利用已建立的禽偏肺病毒四重实时荧光RT-PCR方法进行检测。为了保证检测方法的准确性,通过文献查找已发布的禽偏肺病毒常规RT-PCR检测方法进行验证。结果表明,用本试验筛选的引物和探针建立的禽偏肺病毒四重实时荧光RT-PCR方法检测,将检测模板10倍梯度稀释,A、B和C亚型禽偏肺病毒可以检测到正常扩增曲线的最低模板浓度为102copies/μL,D亚型禽偏肺病毒可以检测到正常扩增曲线的最低模板浓度为103copies/μL,具有较高的灵敏度;取各亚型禽流感病毒和我国流行的其他禽类常见呼吸道病毒进行实时荧光RT-PCR方法检测,结果显示各亚型禽流感病毒和其他禽类常见呼吸道病毒及阴性对照均未出现扩增曲线,具有较高的特异性。在1920份双拭子样品中检测出39份双拭子样品为禽偏肺病毒阳性。其中B亚型禽偏肺病毒32份,感染宿主全部为鸡;C亚型禽偏肺病毒5份,A亚型和C亚型混合感染禽偏肺病毒2份,感染宿主为鸭和鹅。利用已发表的禽偏肺病毒常规RT-PCR检测方法进行验证,均可以扩出正确的目的条带;将RT-PCR产物进行测序,测序结果在NCBI上进行BLAST比对分析,所得结果与建立的检测方法结果一致。两种方法的检测结果符合率为100%。本研究建立的禽偏肺病毒四重实时荧光RT-PCR检测方法,具有良好的特异性和敏感性,可以用于禽偏肺病毒的快速检测同时区分四个亚型,大大提高了检测效率。本研究对8个省/直辖市的1920份拭子样品检测结果表明,我国部分鸡、鸭和鹅存在带毒现象,初步分析了我国部分地区禽群中禽偏肺病毒的分布规律,为下一步检测其他地区禽群中的禽偏肺病毒提供方向,为我国禽偏肺病毒的防治提供正确的理论依据。