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蛋白质组学时代的噬菌体抗体库技术

汕头大学医学院学报 2004年第3期17卷 179-181页

作者：许铭炎邓小玲于晓军汕头大学医学院法医学教研室广东汕头515041 汕头大学医学院卫生学教研室

抗体是蛋白质组学研究的核心工具 ,噬菌体抗体库技术是一种高效的抗体生产技术 ,蛋白质组学研究对该技术提出了新的要求。

关键词：噬菌体抗体库技术蛋白质组学抗体生产综述研究要求核心时代工具

噬菌体抗体库的构建及抗猪脂肪细胞膜单抗的筛选

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中国农业科学 2005年第6期38卷 1260-1263页

作者：苗向阳丁淑燕朱玉良郝慧芳邵建军中国农业大学农业生物技术国家重点实验室北京100094 泰安271018 泰安271018 北京100094 泰安271018 中国农业科学院畜牧研究所山东农业大学动物科技学院山东农业大学动物科技学院中国农业大学农业生物技术国家重点实验室山东农业大学动物科技学院北京100094

用猪脂肪细胞以免疫删减法免疫小鼠,取其脾细胞,RT-PCR扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,克隆入噬菌粒表达载体pCANTAB5E中,构建单链抗体(ScFv)文库。用猪脂肪细胞,对其进行3轮吸附-洗脱-富集,筛选抗猪脂肪细胞膜单抗。经EL... 详细信息

用猪脂肪细胞以免疫删减法免疫小鼠,取其脾细胞,RT-PCR扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,克隆入噬菌粒表达载体pCANTAB5E中,构建单链抗体(ScFv)文库。用猪脂肪细胞,对其进行3轮吸附-洗脱-富集,筛选抗猪脂肪细胞膜单抗。经ELISA检测,51/96克隆具有与猪脂肪细胞结合活性,阳性率为53%,与猪肝细胞则成阴性反应,初步证明了单抗的特异性,为猪脂肪细胞膜单抗的制备提供了一种新的方法。

关键词：单链抗体噬菌体抗体库技术猪脂肪细胞

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用噬菌体抗体库技术筛选单克隆抗体

中国肿瘤生物治疗杂志 1995年第2期2卷 159-164,F003页

作者：张广发陈竞华王雅明徐建军刘华王琰刘群英北京医科大学临床肿瘤学院中国人民解放军海军总医院中心实验科

用噬菌体抗体库技术制备单克隆抗体是近年来抗体技术中的革命性进展,本文简要介绍了我们在这方面所进行的研究工作:从乳癌细胞免疫后的小鼠脾脏细胞和接种过HBsAg疫苗的志愿者的外周血淋巴细胞扩增出k链和Fd段基因,组装到Fab段噬菌体抗... 详细信息

用噬菌体抗体库技术制备单克隆抗体是近年来抗体技术中的革命性进展,本文简要介绍了我们在这方面所进行的研究工作:从乳癌细胞免疫后的小鼠脾脏细胞和接种过HBsAg疫苗的志愿者的外周血淋巴细胞扩增出k链和Fd段基因,组装到Fab段噬菌体抗体表达载体pCOMB3中,分别建立了鼠源性和人源性噬菌体抗体库,以固相化的HBsAg和乳癌细胞为抗原,通过“吸附一洗脱—扩增”富集性筛选过程获得了鼠抗人乳癌细胞和人抗HBsAg的噬菌体抗体,并通过对表达载体的改造,在大肠杆菌表达出了可溶性的Fab段,对所获得的抗体Fab段进行了特异性、亲和力以及DNA序列的分析,显示噬菌体抗体库技术是一个行之有效的抗体制备手段.

关键词：噬菌体抗体库技术单克隆抗体 Fab段乳癌 HB 癌细胞扩增表达载体 DNA序列人源性

小鼠抗人T淋巴细胞表面抗原噬菌体抗体库的构建及筛选

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西安医科大学学报 2002年第3期23卷 239-241,282页

作者：王剑利王一理司履生西安交通大学生命科学院免疫病理研究室西安710061

目的　构建并筛选小鼠抗人静息 /活化T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示抗体库。方法　以人静息 /活化T淋巴细胞免疫Balb/c小鼠 ,取脾细胞 ,RT -PCR扩增VH 和VK 基因 ,拼接为ScFv ,插入噬菌粒载体转化大肠杆菌 ,构建了噬菌体展示抗体库 ,以... 详细信息

目的　构建并筛选小鼠抗人静息 /活化T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示抗体库。方法　以人静息 /活化T淋巴细胞免疫Balb/c小鼠 ,取脾细胞 ,RT -PCR扩增VH 和VK 基因 ,拼接为ScFv ,插入噬菌粒载体转化大肠杆菌 ,构建了噬菌体展示抗体库 ,以人T淋巴细胞为靶抗原 ,对该库进行了 3轮淘洗 ,ELISA方法鉴定噬菌体抗体。结果　成功构建了最大实际库容量为 1 .75× 1 0 6的小鼠抗人静息T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示ScFv抗体库和小鼠抗人活化T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示ScFv抗体库。结论　所构建的抗体库可进一步用于对T淋巴细胞表面蛋白抗原的差异显示分析及构建基因工程抗体。

关键词： T淋巴细胞表面抗原抗体库噬菌体展示单链Fv抗体 T淋巴细胞噬菌体抗体库技术

全人源抗A型产气荚膜梭菌α毒素单分子抗体的研究

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全人源抗A型产气荚膜梭菌α毒素单分子抗体的研究

作者：邱玥吉林农业大学

学位级别：硕士

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringene)是由Wlechii和Nuttad(1892)分离于人腐败尸体血管中的一种条件致病菌,该菌为芽孢杆菌科,梭状芽孢杆菌属,其菌落呈半透明并具有光滑凸起、边缘整齐等特点,多半呈粗杆状形式存在,在... 详细信息

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringene)是由Wlechii和Nuttad(1892)分离于人腐败尸体血管中的一种条件致病菌,该菌为芽孢杆菌科,梭状芽孢杆菌属,其菌落呈半透明并具有光滑凸起、边缘整齐等特点,多半呈粗杆状形式存在,在一般条件下即可生长,其最适生长温度为37～47℃、可分解葡萄糖、麦芽糖等产生大量的二氧化碳和氢气,但不易形成芽孢,当处于无糖环境中、适合的温度及p H值、碳源等比例充足的情况下则有利于形成芽孢,并且芽孢在114℃的高温下能存活1～4h,属条件较温和的专性厌氧菌,也是典型的毒素致病菌。其广泛存在于大自然与人类生活环境中,主要作用于人体消化系统,常见于人畜肠道、食物、土壤、以及粪便中等,因此该菌能够引起人类气性坏疽等疾病,是重要的病原微生物。其重要的外毒素有α、β、ε、ι、γ、δ、θ、η、κ、λ、μ、υ等12种,其中前四种起主要致病作用,可引起多种动物的腹泻、坏死性肠炎和肠毒血症,以及人类食物中毒和痢疾等疾病。因此根据前四种α(CPA)、β(CPB)、ε(ETX)和ι(CPI)致死性毒素的抗毒素中和试验,将其分划为A、B、C、D、E五种类型,这五种类型中,以A型产气荚膜梭菌产生的α毒素为引起多种疾病的关键致病因素。本课题组先期已经利用噬菌体抗体库技术,从全人源单链抗体库Tomlinson I+J中获取了针对A型产气荚膜梭菌α毒素的全人源Sc Fv抗体基因8B,并构建了Sc Fv-8B基因原核表达载体,获得了Sc Fv-8B大肠杆菌表达载菌,为了增加单链抗体的稳定性,本研究将单链抗体进行改构,将Sc Fv-8B与人源抗体恒定区不同结构域相连,构建单分子抗体,筛选免疫结合活性最优的单分子抗体并获得工程菌,对工程菌进行发酵培养,摸索纯化工艺,获得单分子抗体纯品,并进行体外实验以验证抗体的亲和力、免疫结合活性等性质,动物实验则验证抗体的生物学活性。主要研究结果如下:1.根据全人源噬菌体抗体库筛选获得的抗CPA的全人源单链抗体Sc Fv基础上,构建了ATG-Trx A-His Tag-Sumo-(+++++)-Tag表达载体,利用表达载体联合单链抗体轻链和重链恒定区基因组合成五个表达质粒分别为:PET-300-Trx A-Sumo-Sc Fv-CL-CH-CH、P ET-300-Trx A-Sumo-Sc Fv-CH-CH、PET-300-Trx A-Sumo-Sc Fv-CL-CH、PET-300-Trx A-Su mo-Sc Fv-CH、PET-300-Trx A-Sumo-Sc Fv-CL分别转入BL21(DE3)表达菌中,获得五个单分子抗体的表达菌,经IPTG诱导表达后,利用EILSA检测五种单分子抗体蛋白的抗原免疫结合活性,结果显示,Sc Fv-CH-CH(Sc Fv-Fc)的结合活性最高,因此后续实验均采用该重组抗体蛋白来完成。2.对重组表达菌E.coli BL21(DE3)/PET-300-Trx A-Sumo-Sc Fv-Fc进行发酵培养并对发酵产物进行纯化,最终获得Sc Fv-Fc纯品(0.15mg/m L),用LSPR动力学分析显示,制备的Sc Fv-Fc与CPA的亲和常数(KD)为4.89×10(M),说明该抗体对CPA具有较强的亲和力。3.动物实验验证单分子抗体的生物活性。在体内中和试验中,将2×LDCPA与Sc Fv-Fc按照不同比例混合孵育,当CPA与Sc Fv-Fc按1:7、1:8混合时小鼠几乎全部达到保护,当低于1:6时,则开始出现小鼠死亡,得出中和2×LDCPA所需最小Sc Fv-Fc的剂量为14.21mg/kg;在攻毒保护试验中2×Sc Fv-Fc(28.42 mg/kg)的抗体尾静脉注射小鼠,不同时间段以2×LDCPA攻毒,结果显示注射抗体1h内攻毒保护率可达到100%;在攻毒救治试验中,以2×LDCPA进行攻毒,在不同时间以单分子抗体进行救治,结果发现在30min内,救治率达90%,一小时内也高达60%,说明利用Sc Fv-Fc对CPA快速治疗具有很好的效果;小鼠体内半衰期的测定结果显示,Sc Fv-Fc的半衰期为198min±34min,相比较未改进前的Sc Fv体内存留时间(65min±30min)明显更长。本研究成功构建了抗A型产气荚膜梭菌α毒素的重组单分子抗体Sc Fv-Fc,并在体内外对其性质进行了研究,结果显示,构建的单分子抗体具有稳定性高、亲和力高、半衰期长的特点,本研究对蛋白的人源改造及安全性评价提供实验依据。

关键词：抗A产气荚膜梭菌α毒素噬菌体抗体库技术人源单分子抗体重组蛋白

抗体研究进展——纪念刘思职教授诞辰90周年

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中国生物化学与分子生物学报 2019年第8期35卷 816-818页

作者：董志伟北京市肿瘤研究所

受业时,先生时时提及抗体识别的奇妙及种种构想,但由于众所周知的原因均未能实现,想来令人叹惋,毕业后经过一番观苦的'锻炼',于70年代回到研究所重操旧业,便又想到抗体,20年来的教学、科研工作竟与抗体结下不解之缘,显然与先生的影响不... 详细信息

受业时,先生时时提及抗体识别的奇妙及种种构想,但由于众所周知的原因均未能实现,想来令人叹惋,毕业后经过一番观苦的'锻炼',于70年代回到研究所重操旧业,便又想到抗体,20年来的教学、科研工作竟与抗体结下不解之缘,显然与先生的影响不无关系。本文简述抗体研究进展,聊表对先生的纪念。

关键词：大分子噬菌体抗体库技术抗体生成细胞刘思职

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人源化抗血小板膜糖蛋白Ⅵ单链抗体的研究

中华血液学杂志 2009年第9期30卷 588-591页

作者：冀学斌侯明张春青石艳彭军初晓霞马道新李丽珍山东大学齐鲁医院肿瘤中心血液科济南250012

目的用噬菌体抗体库技术研究抑制血小板聚集功能的人源化抗血小板膜糖蛋白（GP）Ⅵ单链抗体。方法从特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者血浆中用单克隆抗体特异性俘获血小板抗原（MAIPA）技术和血小板聚集实验筛选出抑制血小板聚集的抗... 详细信息

目的用噬菌体抗体库技术研究抑制血小板聚集功能的人源化抗血小板膜糖蛋白（GP）Ⅵ单链抗体。方法从特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者血浆中用单克隆抗体特异性俘获血小板抗原（MAIPA）技术和血小板聚集实验筛选出抑制血小板聚集的抗血小板GPⅥ自身抗体。从抗GPⅥ自身抗体阳性患者外周血淋巴细胞中提取mRNA，用RT—PCR扩增出人免疫球蛋白重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因片段，用连接DNA将VH和VL连接成单链抗体（ScFv）基因片段。用限制性内切酶SfiⅠ／NotⅠ酶切ScFv基因片段后克隆到噬菌体载体pHEN2，然后转化大肠杆菌TGI。用辅助噬菌体M13K07援救转化后的TG1，产生单链抗体。用抗原吸附法经过5轮吸附→洗脱→富集，得到纯化的抗GPⅥ单链抗体，并研究其对血小板聚集功能的影响。结果806例慢性ITP患者中11例（1．36％）血浆中抗GPⅥ自身抗体阳性，2例（0．24％）明显抑制胶原诱导的血小板聚集功能。扩增出380—400bp大小的VH和VL基因，用连接肽（Gly4Set）3成功地连接成约800bp大小的ScFv基因片段。将ScFv克隆到pHEN2并转化大肠杆菌TG1后，形成4．1×10^7个克隆。用辅助噬菌体M13K07援救TG1后产生的抗体滴度为2．62×10^10 cfu／ml。亲和层析后得到的纯化抗体可抑制胶原诱导的血小板聚集而对二磷酸腺苷（ADP）诱导的血小板聚集无明显影响。结论利用噬菌体抗体库技术表达的人源化抗血小板GPⅥ抗体ScFv片段可抑制血小板聚集功能。

关键词：紫癜,血小板减少性,特发性自身抗体血小板聚集人源化单链抗体噬菌体抗体库技术

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亲梗死心肌放射免疫显像的研究进展

广东医学 2013年第22期34卷 3514-3516页

作者：陈盼欧阳伟南方医科大学珠江医院核医学科广州510282

放射性核素标记抗心肌肌凝蛋白抗体（AMA）、抗心肌肌凝蛋白轻链抗体（AMLCA）、抗心肌肌凝蛋白重链抗体（AMHCA）、抗肌钙蛋白I抗体（AcTnIMA）、抗肌钙蛋白T抗体（AcTnTMA）及其片段进行心肌放射免疫显像（RII）对各种原因所致的心肌... 详细信息

放射性核素标记抗心肌肌凝蛋白抗体（AMA）、抗心肌肌凝蛋白轻链抗体（AMLCA）、抗心肌肌凝蛋白重链抗体（AMHCA）、抗肌钙蛋白I抗体（AcTnIMA）、抗肌钙蛋白T抗体（AcTnTMA）及其片段进行心肌放射免疫显像（RII）对各种原因所致的心肌损伤特别是心肌梗死（MI）的诊断、疗效及预后的评估具有重要价值,但这些单克隆抗体（McAb）显像诊断有诸多缺点, 使其临床应用受到限制.噬菌体抗体库技术,为生产理想的scFv及发挥抗体RII在心脏病学中的作用带来了新的曙光.

关键词：放射免疫显像梗死心肌噬菌体抗体库技术心肌肌凝蛋白放射性核素标记肌钙蛋白I 蛋白抗体肌凝蛋白轻链

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噬菌粒载体在噬菌体展示中的应用和研究进展

生物技术 2014年第1期24卷 96-100页

作者：张文倩李华琴浙江工业大学药学院浙江杭州310014

噬菌粒载体是包含质粒复制起点的丝状噬菌体衍生载体。噬菌粒通常只编码一种丝状噬菌体的外壳蛋白,其他完成生命周期必须的结构和功能蛋白由辅助噬菌体提供。噬菌粒是噬菌体展示技术最常用的表达载体,它的诸多优点决定了噬菌粒在噬菌体... 详细信息

噬菌粒载体是包含质粒复制起点的丝状噬菌体衍生载体。噬菌粒通常只编码一种丝状噬菌体的外壳蛋白,其他完成生命周期必须的结构和功能蛋白由辅助噬菌体提供。噬菌粒是噬菌体展示技术最常用的表达载体,它的诸多优点决定了噬菌粒在噬菌体展示领域中具有广阔的应用前景。文章概述了噬菌粒载体的结构、生命周期和主要元件,着重介绍了载体的优化策略及应用,最后对其应用前景进行了展望,以期为进一步优化和利用噬菌粒载体提供参考。

关键词：噬菌体展示噬菌粒丝状噬菌体优化策略噬菌体抗体库技术