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嘌呤核苷磷酸化酶不同表达方式对发酵利巴韦林的影响

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现代食品科技 2015年第12期31卷 63-68,62页

作者：刘莉李燕军谢希贤陈宁天津科技大学生物工程学院天津300457 天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室天津300457 代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室天津300457

嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase,由pup G基因编码)是合成利巴韦林的关键酶,本研究考察该酶的质粒过表达和基因组整合表达对鸟苷生产菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208发酵生产利巴韦林的影响。以*** TA208为出发菌株,分别利... 详细信息

嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase,由pup G基因编码)是合成利巴韦林的关键酶,本研究考察该酶的质粒过表达和基因组整合表达对鸟苷生产菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208发酵生产利巴韦林的影响。以*** TA208为出发菌株,分别利用基因过表达和无标记整合技术,成功构建了*** TA2081和TA2082。通过实时定量PCR测定这3株菌pup G基因的转录水平,结果表明与*** TA208相比,TA2081和TA2082的转录水平均有提高,但TA2081提高的更为显著;通过测定PNPase活性发现,*** TA2081和TA2082的PNPase活力分别为出发菌株TA208的2倍和1.30倍。7.5 L分批补料发酵实验表明,与出发菌*** TA208相比,工程菌TA2081鸟苷到利巴韦林的摩尔转化率从20.41%提高到98.63%,TA2082的转化率从20.41%提高到40.95%。综上所述,增加pup G的表达量能提高利巴韦林的产量,本研究为利巴韦林生产菌的代谢工程改造提供了理论依据和技术指导。

关键词：解淀粉芽孢杆菌利巴韦林嘌呤核苷磷酸化酶质粒过表达基因组整合表达

嘌呤核苷磷酸化酶检测体系优化及芒果苷对其活性的影响

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中国药理学通报 2012年第7期28卷 966-969页

作者：袁丽仙牛艳芬高丽辉董馨怡李玲刘旭昆明医学院生物医学工程研究中心云南昆明650500 昆明医学院科研实验中心云南昆明650500

目的优化体外嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase,PNP)活性检测体系,研究芒果苷及芒果苷元对PNP活性的影响。方法采用紫外分光光度法,通过考察酶浓度、底物浓度、二硫苏糖醇(DTT)浓度对酶促反应的影响,确定检测酶活性的... 详细信息

目的优化体外嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase,PNP)活性检测体系,研究芒果苷及芒果苷元对PNP活性的影响。方法采用紫外分光光度法,通过考察酶浓度、底物浓度、二硫苏糖醇(DTT)浓度对酶促反应的影响,确定检测酶活性的最适反应条件,以此为基础研究芒果苷和芒果苷元对PNP活性的影响。结果成功建立并优化了体外PNP活性检测体系,反应温度为25℃时,在磷酸钾盐缓冲液中,当PNP浓度为250 U·L-1、底物鸟苷为400μmol·L-1、DTT为0.5 mmol·L-1的反应条件下于波长258nm处动态监测15 min,芒果苷及其代谢产物苷元在浓度高达100μmol·L-1时,对PNP活性无明显抑制作用。结论以优化的PNP活性检测体系研究发现芒果苷及芒果苷元体外对PNP活性无影响。

关键词：嘌呤核苷磷酸化酶鸟苷芒果苷芒果苷元酶活性紫外分光光度法

嘌呤核苷磷酸化酶/氟达拉滨(PNP/fludarabine)自杀基因系统对人肝癌细胞系BEL7402体外杀伤效应的研究

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胃肠病学 2005年第1期10卷 3-9页

作者：李锋王楚张萍钱关祥上海第二医科大学生物化学与分子生物学教研室 200025

背景:肿瘤细胞内表达的自杀基因可将无毒性的前药转化为高毒性代谢产物以杀伤肿瘤细胞,嘌呤核苷磷酸化酶/氟达拉滨(PNP/fludarabine)自杀基因系统具有目前已知最强的旁观者效应,成为基因治疗领域中的研究热点。目的:研究PNP/fludarabin... 详细信息

背景:肿瘤细胞内表达的自杀基因可将无毒性的前药转化为高毒性代谢产物以杀伤肿瘤细胞,嘌呤核苷磷酸化酶/氟达拉滨(PNP/fludarabine)自杀基因系统具有目前已知最强的旁观者效应,成为基因治疗领域中的研究热点。目的:研究PNP/fludarabine自杀基因系统对人肝癌细胞系BEL7402的体外杀伤效应。方法:应用聚合酶链反应(PCR)从大肠杆菌K12菌株基因组DNA扩增PNP基因,通过8个甘氨酸的接头克隆至真核表达载体pEGFP鄄N1。将pEGFP鄄N鄄PNP以Lipofectamine2000转染BEL7402细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,命名为BEL7402/PNP。应用逆转录(RT)鄄PCR和RNA印迹法(Northernblotting)鉴定PNP基因的表达。分别应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法和AnnexinV鄄FITC凋亡检测试剂盒检测PNP/fludarabine自杀基因系统对BEL7402细胞的细胞毒效应、旁观者效应和诱导凋亡作用。结果:RT鄄PCR和RNA印迹法证实转染的PNP基因能在BEL7402和BEL7402/PNP细胞中表达。低浓度fludarabine对经PNP基因转染的BEL7402细胞具有明显的细胞毒效应;旁观者效应检测显示,10%的BEL7402/PNP细胞与90%的BEL7402细胞混合,经低浓度fludarabine处理,90%的细胞可被杀死;细胞凋亡检测显示,PNP/fludarabine自杀基因系统对BEL7402细胞具有明显的诱导凋亡作用。结论:PNP/

关键词：嘌呤核苷磷酸化酶氟达拉滨自杀基因系统肝癌细胞系 BEL7402 体外杀伤效应

嘌呤核苷磷酸化酶基因的克隆及原核表达载体的构建

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工业微生物 2006年第3期36卷 27-31页

作者：李晓晖孙嘉康高彤任大明陈晓丽刘岩乔宾福复旦大学遗传所遗传工程国家重点实验室上海200433 珍奥集团股份有限公司生物工程研究所大连116620

通过PCR方法从产气肠杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、大肠杆菌扩增嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)基因,然后将扩增的约720bp的基因片段克隆到pET-28b表达载体上,构建重组PNPase的表达载体。核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因在三个菌株之... 详细信息

通过PCR方法从产气肠杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、大肠杆菌扩增嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)基因,然后将扩增的约720bp的基因片段克隆到pET-28b表达载体上,构建重组PNPase的表达载体。核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因在三个菌株之间有很高的同源性。SDS-PAGE电泳结果显示出明显的特异性蛋白质条带,其分子量约为29.8kDa.该载体的构建为进一步研究核苷及其类似物的生物合成奠定基础。

关键词：嘌呤核苷磷酸化酶基因克隆表达载体构建

嘌呤核苷磷酸化酶温敏型表达载体的构建、表达及应用于腺苷转化的研究

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河南农业大学学报 2007年第4期41卷 409-413页

作者：李晓晖徐珠洁梁胜华蒋欣茵任大明复旦大学遗传所遗传工程国家重点实验室上海200433 上海水产大学食品学院上海200090

通过双酶切方法将重组质粒上大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)基因克隆到pBV220表达载体上,构建了温敏型PNPase的表达载体pBV 220-PNP,转化大肠杆菌DH5α并使之表达.SDS-PAGE电泳结果显示出明显的特异表达条带,其分子量约为26 kDa.在... 详细信息

通过双酶切方法将重组质粒上大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)基因克隆到pBV220表达载体上,构建了温敏型PNPase的表达载体pBV 220-PNP,转化大肠杆菌DH5α并使之表达.SDS-PAGE电泳结果显示出明显的特异表达条带,其分子量约为26 kDa.在此基础上研究了不同诱导条件对蛋白表达量的影响.分别以肌苷和尿苷为核糖供体研究重组菌转化腺苷的条件,发现肌苷最适合作为核糖供体,在30 mmol.L-1pH 7.5的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液中,以30 mmol.L-1肌苷和10 mmol.L-1腺嘌呤作底物,加入0.5%基因工程湿菌体60℃反应3 h,腺苷的转化率为85.57%.

关键词：大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶 pBV220 肌苷腺苷

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嘌呤核苷磷酸化酶合成利巴韦林的应用研究

嘌呤核苷磷酸化酶合成利巴韦林的应用研究

作者：戴芳萍华东理工大学

学位级别：硕士

利巴韦林是具有广谱抗病毒的核苷类药物,因其具有高疗效、低毒性、不易产生耐药性等特点而被广泛应用于多种病毒疾病治疗中。酶法合成是利用嘌呤核苷磷酸化酶催化嘌吟核苷与TCA反应生成利巴韦林,具有巨大的工业前景。论文首先对可表达PN... 详细信息

利巴韦林是具有广谱抗病毒的核苷类药物,因其具有高疗效、低毒性、不易产生耐药性等特点而被广泛应用于多种病毒疾病治疗中。酶法合成是利用嘌呤核苷磷酸化酶催化嘌吟核苷与TCA反应生成利巴韦林,具有巨大的工业前景。论文首先对可表达PNPase的乙酰短杆菌的培养条件进行优化,并确定了最佳蛋白胨来源,同时利用响应面法在保证转化率的前提下将菌浓提高到16.8 g/L,提高了25.4%,同时价格降低了28.3%。将三条分别来源于枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌和乙酰短杆菌的基因序列与pET20b载体连接构建重组质粒,并在*** BL21(DE3)中高效表达得到酶BsPNP、BhPNP和BaPNP。通过对三个重组菌的表达条件进行优化,使目的蛋白表达都占总蛋白的50%以上。利用镍柱亲和层析一步纯化目的蛋白,通过SDS-PAGE检测确认得到纯酶。通过对三个蛋白酶的酶学性质进行探究,确定上述三个蛋白酶的最适作用温度分别是65 ℃,75 ℃和65 ℃,最适作用pH分别是7.3,7.0和8.0,并确定它们在pH6.0-11.0条件下都具有良好的pH稳定性,温度稳定性趋势也基本一致,其中BhPNP稳定性最佳,在65℃下孵育1 h后酶活力仍有90%,通过测定动力学参数发现BhPNP的催化能力最高。利用乙酰短杆菌和重组菌合成利巴韦林,通过对比,发现重组菌的转化效率远远高于乙酰短杆菌。通过优化合成工艺,将反应时间由10 h缩短为2h,菌体添加量降低了10倍,底物浓度由100 mmol/L提高到400 mmol/L。

关键词：嘌呤核苷磷酸化酶利巴韦林酶法合成高效液相色谱

嘌呤核苷磷酸化酶在大肠杆菌中的表达及其应用研究

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嘌呤核苷磷酸化酶在大肠杆菌中的表达及其应用研究

作者：李玉淼江南大学

学位级别：硕士

嘌呤核苷磷酸化酶(Purine Nucleoside Phosphorylase,简称PNPase)是一类可逆磷酸化酶,其催化嘌呤核苷分解形成核糖-1-磷酸和相应的嘌呤碱基。针对成品啤酒中嘌呤含量高,长期饮用易引发痛风等问题,论文以pET-28a(+)为载体,构建了PNPase... 详细信息

嘌呤核苷磷酸化酶(Purine Nucleoside Phosphorylase,简称PNPase)是一类可逆磷酸化酶,其催化嘌呤核苷分解形成核糖-1-磷酸和相应的嘌呤碱基。针对成品啤酒中嘌呤含量高,长期饮用易引发痛风等问题,论文以pET-28a(+)为载体,构建了PNPase重组质粒,并在大肠杆菌中表达。分离纯化重组蛋白PNPase,将其应用到糖化醪液中,可将麦汁中嘌呤核苷分解为游离嘌呤碱基,后者在发酵阶段被酵母吸收利用,成品啤酒中嘌呤含量显著降低,为低嘌呤啤酒的生产提供可行性策略。主要研究结果如下:构建pET-28a(+)-PNPase重组质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,对重组蛋白表达条件进行了优化,确定最优条件:37℃培养细胞至OD600=0.6后,加入IPTG至终浓度为0.05 mmol×L,30℃继续诱导表达7 h,经HPLC检测重组菌酶活力为184.46 U·mL。利用His Trap excel亲和层析柱纯化His-Tag融合蛋白,并对纯化产物进行SDS-PAGE电泳和酶活检测,确定其纯度。对PNPase进行酶学性质研究,发现该酶的最适作用pH为7.0,在p H 6.0-10.0条件下有很好的pH稳定性;最适反应温度为60℃,在30-50℃均能保持较高的酶活力;该酶对腺苷、鸟苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷和脱氧肌苷等表现出不同的水解能力,其中以肌苷为底物时所测酶活最高;EDTA、K+可以使酶活稍微升高1.1倍,Na+、Ca、Mg、尿素对酶活力几乎没有影响,Zn、Fe、Mn抑制酶的活力,而1 mmol×L Ag+强烈抑制酶的活力;该酶遵循米氏方程,其动力学参数Vmax=58.82 mol·L·min-1,Km=2.71 mmol·L。将PNPase应用到啤酒的酿造过程中,发现PNPase可有效分解麦汁中结合态的嘌呤核苷,进而提高麦汁中游离嘌呤碱基含量,促使发酵阶段酵母吸收利用更多的游离嘌呤碱基,最终降低啤酒中嘌呤含量。其中以全大麦麦芽为原料酿造啤酒,发酵液中总嘌呤碱基含量可由86.23 mg×L降低至64.89 mg×L;以40%的玉米糖浆为辅料酿造啤酒,发酵液中总嘌呤碱基含量可由53.12 mg×L降低至37.77 mg×L;以30%的小麦麦芽、40%的玉米糖浆作为辅料酿造啤酒,发酵液中总嘌呤碱基含量可由39.59 mg×L降低至31.00mg×L;发酵液中总嘌呤碱基含量大约降低25%左右。

关键词：嘌呤核苷磷酸化酶大肠杆菌嘌呤碱基嘌呤核苷啤酒

假交替单胞菌XM2107嘌呤核苷磷酸化酶基因克隆表达、重组蛋白纯化及酶学性质

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微生物学报 2010年第2期50卷 222-227页

作者：王光路夏俊刚谢希贤徐庆阳陈宁天津科技大学生物工程学院教育部工业微生物重点实验室天津300457

【目的】嘌呤核苷磷酸化酶(PNP,EC.2.***.2.1)在酶法合成核苷类药物及中间体中具有广泛应用。本文研究的目标是,获得极地嗜冷菌假交替单胞菌Pseudoa lteromonas ***2107嘌呤核苷磷酸化酶编码基因,并对该酶酶学性质进行研究,以考察该酶在... 详细信息

【目的】嘌呤核苷磷酸化酶(PNP,EC.2.***.2.1)在酶法合成核苷类药物及中间体中具有广泛应用。本文研究的目标是,获得极地嗜冷菌假交替单胞菌Pseudoa lteromonas ***2107嘌呤核苷磷酸化酶编码基因,并对该酶酶学性质进行研究,以考察该酶在核苷类中间体及药物合成中的潜在应用价值。【方法】利用同源序列PCR技术从Pseudoa lteromonas ***2107基因组DNA中扩增出其编码嘌呤核苷磷酸化酶基因,测序获得编码序列。将该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达以及金属螯合层析纯化,对其酶学性质进行初步研究。【结果】经过测序获得了该酶编码基因序列,全长702 bp,共编码233个氨基酸,大小为25 kDa,Genbank登录号为GQ475485。酶学性质研究发现,该重组酶最适反应温度为50℃,最适酶促反应pH为7.6(25 mmol/L磷酸盐缓冲液),最适酶促反应底物为肌苷(Km值0.389 mmol/L,37℃),且对底物腺苷和鸟苷也有磷酸解活性,在普通温度下具有较高催化活性和较好热稳定性。【结论】来源于Pseudoa lteromonas ***2107的嘌呤核苷磷酸化酶在普通温度条件下具有较高的催化活性及良好热稳定性性质,在核苷类中间体和药物合成中具有较广泛的应用价值。

关键词：假交替单胞菌嘌呤核苷磷酸化酶酶学性质

大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶自杀基因对人胃癌细胞的作用

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吉林大学学报（医学版） 2007年第1期33卷 105-108页

作者：黄颖曹岩郑永晨吉林大学第二医院中心实验室吉林长春130041

目的:探讨大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶自杀基因对胃癌细胞MKN-45的抑制及杀伤作用,并证实旁观者效应。方法:构建真核表达载体pcDNA3.1-ePNP,将重组载体转染MKN-45细胞获得高表达大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因(ePNP)的MKN-45细胞克隆。在MK... 详细信息

目的:探讨大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶自杀基因对胃癌细胞MKN-45的抑制及杀伤作用,并证实旁观者效应。方法:构建真核表达载体pcDNA3.1-ePNP,将重组载体转染MKN-45细胞获得高表达大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因(ePNP)的MKN-45细胞克隆。在MKN-45/ePNP细胞培养物中加入前体药物MePdR,观察MePdR对该细胞的杀伤作用及旁观者效应。结果:随MePdR浓度的增大,MKN-45/ePNP细胞的生存率逐步下降,在MePdR浓度达到1 mg.L-1时MKN-45/ePNP细胞全部被杀灭,而未经转染的MKN-45细胞的生存率则不受影响,MePdR对MKN-45/ePNP有显著的抑制及杀灭作用;当MKN-45/ePNP细胞占总细胞的10%时,全部细胞被杀死。结论:ePNP/MePdR自杀基因系统对胃癌细胞有生长抑制及杀伤作用并具有旁观者效应。

关键词：胃肿瘤自杀基因旁观者效应大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶