嘌呤核苷磷酸化酶在大肠杆菌中的表达及其应用研究

作     者：李玉淼 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陆健

授予年度：2016年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：嘌呤核苷磷酸化酶 大肠杆菌 嘌呤碱基 嘌呤核苷 啤酒 

摘      要：嘌呤核苷磷酸化酶(Purine Nucleoside Phosphorylase,简称PNPase)是一类可逆磷酸化酶,其催化嘌呤核苷分解形成核糖-1-磷酸和相应的嘌呤碱基。针对成品啤酒中嘌呤含量高,长期饮用易引发痛风等问题,论文以pET-28a(+)为载体,构建了PNPase重组质粒,并在大肠杆菌中表达。分离纯化重组蛋白PNPase,将其应用到糖化醪液中,可将麦汁中嘌呤核苷分解为游离嘌呤碱基,后者在发酵阶段被酵母吸收利用,成品啤酒中嘌呤含量显著降低,为低嘌呤啤酒的生产提供可行性策略。主要研究结果如下:构建pET-28a(+)-PNPase重组质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,对重组蛋白表达条件进行了优化,确定最优条件:37℃培养细胞至OD600=0.6后,加入IPTG至终浓度为0.05 mmol×L,30℃继续诱导表达7 h,经HPLC检测重组菌酶活力为184.46 U·mL。利用His Trap excel亲和层析柱纯化His-Tag融合蛋白,并对纯化产物进行SDS-PAGE电泳和酶活检测,确定其纯度。对PNPase进行酶学性质研究,发现该酶的最适作用pH为7.0,在p H 6.0-10.0条件下有很好的pH稳定性;最适反应温度为60℃,在30-50℃均能保持较高的酶活力;该酶对腺苷、鸟苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷和脱氧肌苷等表现出不同的水解能力,其中以肌苷为底物时所测酶活最高;EDTA、K+可以使酶活稍微升高1.1倍,Na+、Ca、Mg、尿素对酶活力几乎没有影响,Zn、Fe、Mn抑制酶的活力,而1 mmol×L Ag+强烈抑制酶的活力;该酶遵循米氏方程,其动力学参数Vmax=58.82 mol·L·min-1,Km=2.71 mmol·L。将PNPase应用到啤酒的酿造过程中,发现PNPase可有效分解麦汁中结合态的嘌呤核苷,进而提高麦汁中游离嘌呤碱基含量,促使发酵阶段酵母吸收利用更多的游离嘌呤碱基,最终降低啤酒中嘌呤含量。其中以全大麦麦芽为原料酿造啤酒,发酵液中总嘌呤碱基含量可由86.23 mg×L降低至64.89 mg×L;以40%的玉米糖浆为辅料酿造啤酒,发酵液中总嘌呤碱基含量可由53.12 mg×L降低至37.77 mg×L;以30%的小麦麦芽、40%的玉米糖浆作为辅料酿造啤酒,发酵液中总嘌呤碱基含量可由39.59 mg×L降低至31.00mg×L;发酵液中总嘌呤碱基含量大约降低25%左右。