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利用大肠杆菌细胞工厂生产吲哚-3-乙酸的研究

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中国生物工程杂志 2021年第1期41卷 12-19页

作者：吴弘轩杨金花沈培杰李清晨黄建忠祁峰福建师范大学生命科学学院工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心福州350117 福建师范大学细胞逆境响应与代谢调控福建省高校重点实验室福州350108

目的:利用重组大肠杆菌全细胞转化色氨酸生产IAA。方法:在大肠杆菌胞内构建两条全新的IAA合成途径,即吲哚-3-乙酰胺(indole-3-acetamide,IAM)途径和色胺(tryptamine,TRP)途径。结果:IAM途径涉及两个酶,分别是色氨酸-2-单加氧酶(IAAM)和... 详细信息

目的:利用重组大肠杆菌全细胞转化色氨酸生产IAA。方法:在大肠杆菌胞内构建两条全新的IAA合成途径,即吲哚-3-乙酰胺(indole-3-acetamide,IAM)途径和色胺(tryptamine,TRP)途径。结果:IAM途径涉及两个酶,分别是色氨酸-2-单加氧酶(IAAM)和酰胺酶(AMI1),构建好的重组大肠杆菌TPA-4以2g/L的色氨酸为底物,可以产生0.803g/L的IAA;敲除控制色氨酸合成副产物吲哚的tnaA基因后,菌株MPA-3的IAA产量达到1.43g/L,提高了78%。第二条TRP途径合成IAA涉及三个酶:左旋色氨酸脱羧酶(TDC),二胺氧化酶(AOC1)和吲哚-3-乙醛脱氢酶(IAD1)。包含这条途径的重组大肠杆菌TPTA-2以2g/L的色氨酸为底物能够合成13.0mg/L的IAA。在菌株MPTA-3中,最终产生了21.0mg/L的IAA,产量增加了61.5%。结论:首次通过IAM途径和TRP途径利用重组大肠杆菌全细胞催化生产IAA,其中IAM途径的IAA产量较高,有较高的工业化应用前景。

关键词：色氨酸吲哚-3-乙酸吲哚-3-乙酰胺色胺全细胞催化大肠杆菌

利用细菌表面展示技术强化细胞固定化生产吲哚-3-乙酸

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福建农业科技 2022年第8期53卷 14-22页

作者：苏愉刘晴浩包心茹黄建忠祁峰福建师范大学生命科学学院工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心福建福州350117 福建师范大学细胞逆境响应与代谢调控福建省高校重点实验室福建福州350108

目的利用细菌表面展示技术,以冰晶核蛋白INaA、INaK为锚定蛋白,将负电荷的氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)锚定在大肠杆菌表面(Escherichia coli),增加细胞膜表面携带的负电荷,与改性后带正电荷的生物炭吸附以强化生物炭固定化细胞的功能。利... 详细信息

目的利用细菌表面展示技术,以冰晶核蛋白INaA、INaK为锚定蛋白,将负电荷的氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)锚定在大肠杆菌表面(Escherichia coli),增加细胞膜表面携带的负电荷,与改性后带正电荷的生物炭吸附以强化生物炭固定化细胞的功能。利用2 mol·L^(-1)的FeCl_(3)改性玉米秸秆生物炭使其呈正电性,将改性生物炭与细胞表面负电荷增加的重组菌株进行静电吸附,重组菌株EPA03与对照菌株相比吸附率提高31.75%。将此策略应用在固定化细胞高效生产IAA的菌株中,在全细胞催化连续循环中,菌株EPA03连续循环中能连续反应6个循环,IAA积累量比对照菌株提高了42.85%。

关键词：生物炭固定化细胞细菌表面展示技术大肠杆菌吲哚-3-乙酸

超高效液相色谱-串联质谱法同时检测植物叶片中吲哚-3-乙酸及其3种氧化产物

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分析测试学报 2017年第6期36卷 732-737页

作者：刘志航李平亮周斐罗小勇青岛农业大学化学与药学院山东青岛266109 青岛农业大学农学与植物保护学院山东青岛266109

以玉米叶片为供试材料,建立了同时测定植物体内吲哚-3-乙酸(IAA)及其3种氧化产物吲哚-3-甲醇(ICI)、吲哚-3-甲醛(ICA)、吲哚-3-羧酸(IFA)含量的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)方法。结果表明,该方法对IAA及其3种氧化产物检测的线... 详细信息

以玉米叶片为供试材料,建立了同时测定植物体内吲哚-3-乙酸(IAA)及其3种氧化产物吲哚-3-甲醇(ICI)、吲哚-3-甲醛(ICA)、吲哚-3-羧酸(IFA)含量的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)方法。结果表明,该方法对IAA及其3种氧化产物检测的线性、精密度和重复性较好,灵敏度较高,4种化合物的检出限为0.002~1.63μg/kg,定量下限为0.007~5.43μg/kg;方法的加标回收率为89.5%~95.3%,相对标准偏差为2.3%~5.1%。玉米叶片的实际测定结果表明,IAA,ICI,ICA和IFA的含量分别为(196.25±7.10),(26.21±2.13),(18.65±2.02),(13.62±2.06)μg/kg。该方法已成功应用于小麦、豌豆、硬毛刺苞菊叶片的测定,通用性较好。

关键词：玉米叶片吲哚-3-乙酸吲哚-3-甲醇吲哚-3-甲醛吲哚-3-羧酸超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)

新型吲哚-3-乙酸类Bcl-2蛋白抑制剂的设计、合成与初步活性评价

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新型吲哚-3-乙酸类Bcl-2蛋白抑制剂的设计、合成与初步活性评价

作者：徐广森山东大学

学位级别：硕士

癌症作为威胁人类健康的第二大杀手,发病人数呈逐年递增趋势。虽然,研究者们已经发展出了应对癌症的多种治疗方法（化疗、放疗、诱导疗法等）;但人类距离战胜癌症还有很远的路要走。面对恶性肿瘤这一重大课题,药物化学家们,发现了不同... 详细信息

癌症作为威胁人类健康的第二大杀手,发病人数呈逐年递增趋势。虽然,研究者们已经发展出了应对癌症的多种治疗方法（化疗、放疗、诱导疗法等）;但人类距离战胜癌症还有很远的路要走。面对恶性肿瘤这一重大课题,药物化学家们,发现了不同种类的化学治疗药物。其中不乏一些表现出显著治疗效果的分子,但副反应和耐药性,却如同魔咒一般如影随行。而细胞凋亡逃逸便是耐药性发生的一条重要途径。作为细胞凋亡过程的重要调节剂,Bcl-2蛋白家族的表达异常在细胞凋亡逃逸中扮演着重要的角色。其中,Bcl-2,Mcl-1,Bcl-XL等抗凋亡蛋白,在多种肿瘤细胞都被发现存在过表达现象。因此,抑制Bcl-2抗凋亡蛋白成为了一个重要的抗肿瘤方向。基于本课题组多年来在Bcl-2抑制剂相关研究的积淀,借鉴国际同行的相关成果。我们设计并合成了两个系列,共计29个全新结构的吲哚-3-乙酸类Bcl-2蛋白抑制剂。所有目标化合物均利用1H-NMR、13C-NMR和HRMS进行结构确证。随后我们分别通过FPAs和MTT法分别对目标化合物进行了蛋白抑制活性和抗肿瘤细胞增殖活性的评价。可喜的是,我们从中筛选出了多个活性优于阳性对照WL-276的活性分子。目标化合物9c,9d,9h和10b均表现出优于WL-276的Bcl-2/Mcl-l双重抑制活性,以及更强的抗肿瘤细胞增殖活性。同时,以上四个目标化合物对Bcl-XL蛋白并未表现出明显的抑制作用,这也为规避副反应——血小板减少症,创造了可能。其中,化合物9h表现出最均衡的Bcl-2/Mcl-l抑制活性及最强的抗肿瘤细胞增殖活性。该工作也为开发具有亚型选择性的Bcl-2/Mcl-1双重抑制剂打下了基础。

关键词：细胞凋亡 Bcl-2抑制剂抗肿瘤吲哚-3-乙酸

三维荧光二阶校正法同时测定水果样中α-萘乙酸和吲哚-3-乙酸

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化学通报 2011年第1期74卷 47-53页

作者：蔡晴吴海龙李元娜唐雷鸣刘翊萱俞汝勤湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室国家级基础化学实验教学示范中心长沙410082 中国科学院

将三维荧光光谱技术与分别基于交替惩罚三线性分解(APTLD)和平行因子分析(PARAFAC)2种算法的二阶校正方法相结合,实现了水果样中α-萘乙酸(NAA)和吲哚-3-乙酸(IAA)含量的直接快速同时定量测定。对于西瓜提取液,在量测体系选取的组分数为... 详细信息

将三维荧光光谱技术与分别基于交替惩罚三线性分解(APTLD)和平行因子分析(PARAFAC)2种算法的二阶校正方法相结合,实现了水果样中α-萘乙酸(NAA)和吲哚-3-乙酸(IAA)含量的直接快速同时定量测定。对于西瓜提取液,在量测体系选取的组分数为3时,采用APTLD二阶校正法所获得的NAA和IAA的平均回收率分别为(103.8±7.5)%和(95.2±5.9)%;采用PARAFAC二阶校正法所获得的平均回收率分别为(101.0±4.6)%和(96.8±4.5)%。另外,采用椭圆置信区间测试和品质因子如灵敏度、选择性和检测下限,评估了2种算法的准确性。实验结果表明,这2种方法均能成功用于直接定量分析水果样中NAA和IAA的含量,且方法快速简便,比其它分析方法既节约试剂又节约时间,是1种直接快速分析复杂体系中感兴趣组分植物生长激素的有力工具。

关键词： α-萘乙酸吲哚-3-乙酸三维荧光二阶校正交替惩罚三线性分解平行因子分析水果

吲哚-3-乙酸对果实的诱导抗性作用及其与γ-氨基丁酸的关系初探

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吲哚-3-乙酸对果实的诱导抗性作用及其与γ-氨基丁酸的关系初探

作者：张嘉惠浙江大学

学位级别：硕士

在果蔬采后储藏、运输和销售过程中,真菌性病害是引起损失的主要原因之一。化学杀菌剂是控制采后病害的主要方法,但由于对环境和人体健康会产生不良影响,其使用的种类和范围愈发受到规范和限制。近些年来,利用物理、化学和生物激发子诱... 详细信息

在果蔬采后储藏、运输和销售过程中,真菌性病害是引起损失的主要原因之一。化学杀菌剂是控制采后病害的主要方法,但由于对环境和人体健康会产生不良影响,其使用的种类和范围愈发受到规范和限制。近些年来,利用物理、化学和生物激发子诱导果实对广谱病原菌产生持久的抗性来抑制病害的方式越来越受到广泛的关注。近年来的研究表明生长素不仅是植物中重要的生理调节因子,而且在微生物致病机理和植物防御机制中也扮演了重要的角色。虽然生长素在植物病害和防御方面的功能已经有了较为广泛的探索,但只有少数研究报道了生长素作为外源激发子对果实采后病害的影响,且其机理也尚不明确。基于此,本论文以生长素,特别是生长素中活性最强的吲哚-3-乙酸(indole-3-aceticacid,IAA)为外源激发子,研究了其对梨果实和樱桃番茄果实的抗性诱导作用及其主要影响因素,并通过分析IAA对病原菌、果实品质、果实抗性相关生理生化指标、植物抗性相关激素合成通路和信号通路、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)支路(GABAshunt)等的影响,进一步明确了 IAA对果实抗性诱导的机制。主要研究结论如下:(1)不论是内源生长素,IAA、吲哚-3-丁酸(IBA),还是化学合成生长素2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、1-萘乙酸(NAA)都可以诱导梨果实对扩展青霉(Penicilliumexpansum)产生抗性,且其诱导效果与GABA接近。IAA的诱导效果与其浓度和诱导时间有关,当浓度为100-500μgmL-1、诱导时间为24-48h时,IAA可以显著诱导梨果实产生抗性。同时,体内外试验表明,IAA不能直接抑制P.expansum的生长。对梨果实抗性相关酶活性以及基因的测定结果显示,IAA处理可以显著增强超氧化物歧化酶(SOD)、β-1,3-葡聚糖酶(GLU)、几丁质酶(CHI)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性,同时也能显著提高endoglu9、CHI4、PR1、PR4和PAL的基因转录水平,表明IAA诱导梨果实抗性的机制可能与SOD和PAL活性的增强、PR蛋白积累和PR蛋白基因表达等有关。对果实品质影响的测定结果表明,不同浓度的IAA对梨果实的硬度、可溶性固形物含量、可滴定酸度和VC含量均没有显著的影响。(2)IAA可以显著诱导樱桃番茄果实对链格孢(Alternariaalternata)产生抗性,且其诱导效果与GABA接近。樱桃番茄果实抗性相关生理指标的测定结果表明,IAA处理能显著增强果实SOD、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)的活性,减少丙二醛(MDA)在果实上的积累,表明IAA诱导樱桃番茄果实的抗性与其对果实活性氧代谢的调节有关。此外,IAA能刺激果实GLU和CHI酶活性的升高,表明IAA诱导樱桃番茄果实的抗性与PR蛋白的积累有关。(3)IAA对樱桃番茄中的经典抗性相关植物激素水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)的合成和信号途径有较大的影响。在SA合成路径中,IAA显著提高了 PAL5、PAL7的转录水平,而对ICS1的基因表达没有影响,表明IAA在转录水平上可能通过刺激PAL路径来合成SA;在SA信号路径中,NPR1、TGA1、TGA2、WRKY70的基因转录水平在IAA处理后显著上调,表明IAA在转录水平上可能促进SA信号转导路径的表达。IAA可以提高AOS2和MYZ2的基因表达水平,但对LOX1的基因表达有抑制作用,并且强烈刺激了负调节因子JAZ1的基因表达,表明IAA在转录水平上可能具有抑制JA合成路径和信号转导路径表达的作用;IAA可以显著提高ACS1、ETR1、MPK3和MPK6的基因表达水平,表明IAA在转录水平上可能具有促进ET合成路径和信号转导路径表达的作用。(4)IAA与GABA代谢关系密切。外源IAA处理不仅可以提高樱桃番茄果实GABA的含量,而且还刺激了 GABA支路中关键酶的基因表达:GAD1、GAD2、GAD3和GABA-TP1的基因转录表达均在IAA处理后显著增强,但IAA处理对SSADH的基因表达具有显著的抑制作用。此外,外源GABA处理可以提高樱桃番茄果实IAA的含量。

关键词：吲哚-3-乙酸植物激素 γ-氨基丁酸诱导抗性采后病害

普城沙雷氏菌吲哚-3-乙酸与群体感应信号的相互作用

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普城沙雷氏菌吲哚-3-乙酸与群体感应信号的相互作用

作者：杨扬江苏大学

学位级别：硕士

N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子(AHLs)介导的群体感应(Quorum sensing,QS)系统在革兰氏阴性细菌中广泛存在,通过分泌化学信号分子AHLs(自诱导因子)感知周围环境细菌密度,从而调控相关基因表达并进一步影响细菌生理和行为。QS系统全局调... 详细信息

N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子(AHLs)介导的群体感应(Quorum sensing,QS)系统在革兰氏阴性细菌中广泛存在,通过分泌化学信号分子AHLs(自诱导因子)感知周围环境细菌密度,从而调控相关基因表达并进一步影响细菌生理和行为。QS系统全局调控细菌的多种表型,例如毒力因子、运动性、抗生素分泌和生物膜形成等。Serratia plymuthica G3菌株分离于小麦内茎,能够产生几丁质酶、蛋白酶和抗生素等抑制植物病原菌,同时具有IAA合成能力促进植物生长。已知菌株G3中存在由Spl IR,SpsIR 2个QS系统和1个Lux R同系物SptR组成的复杂QS调控网络。对G3基因组进行生物信息学分析发现存在双拷贝的ipdC基因通过吲哚-3-丙酮酸(Indole-3-pyruvic acid,IPyA)途径参与IAA合成。本文主要探究G3菌株中IAA与群体感应信号的相互作用,首先运用基因替换、同源重组的方法构建了群体感应调控子相关突变体及ipdC-2双突变体,并进行了功能分析;另一方面基于lux的转录融合构建和分析调查了QS网络内部不同调控子间的相互作用以及QS与IAA信号通路间的相互作用。取得的主要研究结果如下:(1)构建了spsI/splI基因双突变体,splR、spsR单突变体,以及ipdC-2双突变体,进一步表型分析表明不同突变体对AHL信号合成、蛋白酶活性、swimming运动性、IAA及乙偶姻合成等表型产生不同程度的影响。(2)基于lux转录融合分析并组合添加外源AHL信号分子实验,结果表明splI自我正调控,同时正调控spsI、splR、spsR、sptR基因的转录;spsI自我正调控,也正调控splI、splR、spsR、sptR基因的转录;splR自我负调控,但正调控splI、spsI、spsR基因的转录;spsR自我正调控,也正调控splR、splI、spsI基因的转录;splR与spsR对sptR都无调控作用。该实验结果进一步完善了对G3菌株中QS系统转录水平的调控网络分析和认识。(3)基于lux转录融合分析组合添加外源IAA生长素,完成了IAA信号的自我调控分析。结果表明2个拷贝IAA生物合成关键酶(吲哚-3-丙酮酸脱羧酶)ipdC和ipdC基因均受IAA的自身诱导,形成自我正反馈调控;另外IAA前体物质色氨酸(Trp)也正调控ipdC和ipdC基因表达。(4)进一步通过突变分析组合添加外源IAA或AHLs分析了ipdC基因与群体感应调控子间的相互作用,结果表明ipdC和ipdC基因和IAA均负调控splI、spsI、splR、spsR、sptR基因的转录;同样splI、spsI、splR、spsR和AHLs也都负调控ipdC和ipdC基因的转录,在转录水平系统分析了IAA与群体感应信号间的相互作用。以上研究结果增加了对QS和IAA信号通路间互作的认识,对于遗传操纵生防细菌提高其生物防治效率和稳定性具有一定的理论指导意义和实践价值。

关键词：沙雷氏菌生物防治群体感应 AHL信号分子吲哚-3-乙酸

吲哚-3-乙酸分子印迹聚合物的制备及其应用研究

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吲哚-3-乙酸分子印迹聚合物的制备及其应用研究

作者：郭洹铭湖南农业大学

学位级别：硕士

吲哚-3-乙酸(indole 3-acetic acid, IAA)是植物体内重要的植物激素。植物样品中IAA的高效提取和精确测定对于研究其在植物生命活动的调节作用具有非常重要的意义。本文采用分子印迹技术制备对模板分子IAA具有特异选择吸附性的聚合物,... 详细信息

吲哚-3-乙酸(indole 3-acetic acid, IAA)是植物体内重要的植物激素。植物样品中IAA的高效提取和精确测定对于研究其在植物生命活动的调节作用具有非常重要的意义。本文采用分子印迹技术制备对模板分子IAA具有特异选择吸附性的聚合物,通过筛选合适的单体和致孔剂、优化制备条件、印迹聚合物表征分析以及将该聚合物应用于拟南芥植物样品中IAA的固相萃取,所得结果如下：1、在制备IAA分子印迹聚合物(IAA-MIP)时,反应体系的选择对于提高MIP的亲和力和选择性十分重要。以3种常用的致孔剂甲苯、甲醇和乙腈进行的溶解实验表明,乙腈作为致孔剂的聚合实验效果最好。本试验最后确立了本体聚合法制备IAA分子印迹聚合物的条件是以IAA为模板、甲基丙烯酸为功能单体、乙腈为致孔剂,模板与功能单体比例为1：8时,在50℃水浴中避光聚合24 h。2、IAA-MIP的红外光谱分析表明,模板分子IAA是以氢键结合在与印迹聚合物的空腔中。吸附等温线及Scatchard分析表明IAA-MIP比空白聚合物(NIP)结合IAA的能力强,且具有两种结合方式,其解离常数分别为KD1=1.04×10-6 mol/L和KD2=9.23×10-6mol/L。最大表观结合位点BMax1=0.10 μmol/g和BMax2=0.28μmol/g。3、对植物样品的固相萃取试验表明,制备的IAA-MIP对于IAA分子具有较强的特异性吸附能力,IAA样品回收率达到62.64%。

关键词：吲哚-3-乙酸分子印迹聚合物本体聚合固相萃取吸附性能

导数同步荧光法同时测定吲哚-3-乙酸和萘氧乙酸

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分析试验室 2013年第8期32卷 7-10页

作者：刘香香万益群南昌大学分析测试中心南昌330047 食品科学与技术国家重点实验室南昌330047

采用荧光光谱法同时测定混合物体系中萘氧乙酸(BNOA)和吲哚-3-乙酸(IAA)两种植物激素。在pH 8.5的条件下,以水为溶剂,选择Δλ=100 nm,在200～500 nm的波长范围对两者的混合物进行了同步荧光光谱扫描,并做一阶导数处理,对其进行定量分析... 详细信息

采用荧光光谱法同时测定混合物体系中萘氧乙酸(BNOA)和吲哚-3-乙酸(IAA)两种植物激素。在pH 8.5的条件下,以水为溶剂,选择Δλ=100 nm,在200～500 nm的波长范围对两者的混合物进行了同步荧光光谱扫描,并做一阶导数处理,对其进行定量分析。BNOA和IAA的线性范围是0.01～0.3μg/mL和0.045～0.64μg/mL,检出限分别为0.003μg/mL和0.012μg/mL。方法用于果蔬中BNOA和IAA的同时检测,效果良好。该法可作为植物激素快速检测方法。

关键词：导数同步荧光萘氧乙酸吲哚-3-乙酸植物激素