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喜厌氧环境启动子的筛选及在大肠杆菌丙氨酸产生菌中的应用

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喜厌氧环境启动子的筛选及在大肠杆菌丙氨酸产生菌中的应用

作者：赵启超河北大学

学位级别：硕士

细菌启动子是细菌基因表达中需要的一种调节序列,它决定了基因表达的机会和强度。通过插入或删除启动子,可以改变细菌基因的表达,以研究生长和代谢调节。微生物基因组通过酶切得到含有启动子的随机片段,可供进一步修饰或直接用于增强基... 详细信息

细菌启动子是细菌基因表达中需要的一种调节序列,它决定了基因表达的机会和强度。通过插入或删除启动子,可以改变细菌基因的表达,以研究生长和代谢调节。微生物基因组通过酶切得到含有启动子的随机片段,可供进一步修饰或直接用于增强基因表达。本研究通过对大肠杆菌基因组上启动子的筛选及改造,旨在构建一套厌氧代谢为主的内源启动子元件系统,以期应用于L-丙氨酸产生菌株。通过鸟枪法从大肠杆菌K-12MG1655基因组中筛选在厌氧下具有启动活性的DNA片段。根据生信软件对其进行初步预测,判断DNA片段中启动子的功能区域。对筛选的DNA片段进行体内体外表征,验证其生物活性及生物学属性。将筛选鉴定的喜厌氧启动子通过应用于L-丙氨酸产生菌,具体研究如下:1.使用Sau3AⅠ和高质量片段化酶切MG1655基因组,将酶切片段克隆到含氯霉素乙酰转移酶报告基因的p KK232-8质粒上,在无氧环境下逐步提高氯霉素浓度,从而筛选具有启动活性的DNA片段。本实验共筛选出22个含启动活性的随机片段,并利用Soft Berry软件初步预测启动子功能结构。2.体内试验通过对DNA片段截短及转录、翻译水平分析,确定启动活性区域,及启动强度。转录水平采用实时荧光定量PCR技术来测定氯霉素乙酰转移酶m RNA的表达量来分析。翻译水平通过测定各克隆子绿色荧光蛋白的相对荧光强度来检测。体外试验主要根据RNA聚合酶与启动子区域的特异性识别与结合进行鉴定。依据生信预测及截短结果,利用凝胶迁移率试验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)验证DNA片段与RNA聚合酶的相互作用,从而定性的判断所选DNA片段是否含有启动子结构。经验证DNA片段G1.1、G8.1、G9.1、G19.1均含有启动子,且在转录和翻译水平G19.1、G9.1、G1.1在无氧环境启动活性均强于有氧环境。3.启动子G1.1、G9.1、G19.1通过CRISPR/Cas9基因编辑技术替换到L-丙氨酸产生菌中。在MG1655-818基础上,G1.1、G9.1、G19.1替换dad X通路的tac启动子,成功构建菌株MG1655-818-G1.1、MG1655-818-G9.1、MG1655-818-G19.1。出发菌株及基因编辑菌株MG1655-818-G1.1、MG1655-818-G9.1、MG1655-818-G19.1经摇瓶发酵后的L-丙氨酸积累量分别为1.147 g/L/22 h、1.133 g/L/22 h、1.18 g/L/22 h、1.387 g/L/22 h,表明使用本研究筛选的强厌氧启动子替换L-丙氨酸代谢路径关键酶的启动子对L-丙氨酸的积累量的具有一定的提升效果。

关键词：启动子筛选启动子替换启动子活性分析 L-丙氨酸基因编辑 L-丙氨酸发酵

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作者：王泽浙江大学

学位级别：硕士

大豆是世界范围内重要的经济作物,也是我国最重要的粮食作物与经济作物之一,关系到我国粮食安全战略性布局,同时大豆的产量与品质也与大众的生活息息相关。近年来,全球气候变化加剧,我国严寒、高温、干旱、洪涝灾害频发,同时自然灾害会... 详细信息

大豆是世界范围内重要的经济作物,也是我国最重要的粮食作物与经济作物之一,关系到我国粮食安全战略性布局,同时大豆的产量与品质也与大众的生活息息相关。近年来,全球气候变化加剧,我国严寒、高温、干旱、洪涝灾害频发,同时自然灾害会连锁引发一系列病虫灾害,生物胁迫与非生物胁迫共同威胁着大豆的产量与品质。因此,通过遗传学、分子生物学等微观层面研究植物响应胁迫机制,并鉴定重要基因的功能,然后利用生物技术手段提高大豆的抗病抗逆性及品质,对保证我国大豆产业健康发展起着重要作用。本文先以大豆(Glycine max)为材料,研究了大豆胞囊线虫(Soybean cyst nematode,SCN)诱导相关基因NIG(Nematode induced-gene)的启动子受大豆胞囊线虫的诱导启动情况,初步鉴定出受大豆胞囊线虫特异性诱导启动的启动子,对大豆胞囊线虫抗性相关机理研究与大豆胞囊线虫抗性转基因品种培育起到积极的作用。另外以大豆(Glycine max)为材料,运用amiRNA(Artificial microRNA)及VIGS(Virus-induced gene silencing)基因沉默技术研究GmExo70J, GmWRP1基因与大豆根瘤及大豆叶片衰老的关系,为提高大豆的产量与品质有着积极的现实意义。所得主要结果有：1.筛选出受大豆胞囊线虫特异性诱导的启动子NIG基因受大豆胞囊线虫的诱导表达量会有所上调,所以NIG基因有可能与大豆胞囊线虫的抗性具有相关性。利用Promter-GUS融合方法指示启动子的受诱导情况,通过发根农杆菌介导获得NIG Promoter-GUS发状根,接种大豆胞囊线虫5/10天后与对照比较,筛选出NIG7 Promoter、NIG 13 Promoter受大豆胞囊线虫特异性诱导启动。2.发现了GmExo70J、GmWRP1能够促进大豆结瘤利用AmiRNA (Artificial microRNA)技术沉默GmExo70J、GmWRP1的表达,通过发根农杆菌介导获得GmExo70J、GmWRP1-amiRNA发状根,接种根瘤菌30天后,与对照比较发现GmExo70J7、GmExo70J9、 GmWRP1-amiRN A发状根单位质量的根瘤数显著减少,说明GmExo70J、 GmWRP1会促进大豆结瘤。将GmExo70J7、GmExo70J9的Promoter与GUS融合,通过发根农杆菌介导获得GmExo70J7、GmExo70J9 Promoter-GUS发状根后,接种根瘤菌3天后与对照比较,发现接种根瘤后GmExo70J7、GmExo70J9 Promoter的启动受到显著的抑制。说明过多的根瘤会拮抗GmExo70J7、GmExo70J9 Promoter的启动,从而一定程度上抑制根瘤的产生,通过负反馈调节机制使根瘤数量处在稳态水平。3. 发现了GmExo 70J7、GmExo 70J8能够延缓大豆叶片衰老利用Virus induced gene silencing (VIGS)技术,通过基因枪介导沉默GmExo 70J的表达,降低大豆植株GmExo70J的转录丰度,发现GmExo70J7、 GmExo70J8-VIGS植株与对照相比叶片显著变黄,出现明显的早衰现象,说明GmExo 70J7、GmExo 70J8能够延缓大豆叶片的衰老。

关键词：大豆大豆胞囊线虫 NIG 大豆发根启动子筛选 GmWRP1 GmExo70J amiRNA 根瘤 VIGS 衰老

布鲁氏菌强启动子的筛选及重组口蹄疫病毒VP1基因的表达

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布鲁氏菌强启动子的筛选及重组口蹄疫病毒VP1基因的表达

作者：孙翠丽山东农业大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌引起的一种重要的人兽共患病,2012年我国国务院印发了《国家中长期动物疫病防治规划(2011-2020年)》,将布病列为优先防治的国内16种动物疫病之一,并作为当前防控工作的重中之重。该病对畜... 详细信息

布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌引起的一种重要的人兽共患病,2012年我国国务院印发了《国家中长期动物疫病防治规划(2011-2020年)》,将布病列为优先防治的国内16种动物疫病之一,并作为当前防控工作的重中之重。该病对畜牧业和人类健康均构成严重威胁,使用疫苗免疫是防控布氏菌病的重要措施之一。目前,我国用于控制布病的疫苗主要是S2株(猪型2号苗),其具有毒力较弱、免疫效果良好、安全性高等特点。布鲁氏菌能够引起机体强烈的Th1型免疫应答,这使得布鲁氏菌成为理想的异源性抗原载体,为了开发出能高效表达外源基因的布鲁氏菌活载体疫苗,在本课题中我们首先使用绿色荧光蛋白作为报告基因,将布鲁氏菌组成型启动子Psod、Pdnaj和Pdnak分别克隆入YGT-p BBR1mcs2,得到重组表达载体YGTp BBR1mcs2-Pdnaj、YGT-p BBR1mcs2-Psod和YGT-p BBR1mcs2-Pdnak并转化至布鲁氏菌。荧光显微镜检测GFP蛋白的表达情况。结果表明,3种不同强度的启动子均能在布鲁氏菌S2中启动GFP基因的表达且启动能力由强到弱依次为:Pdnak、Pdnaj、Psod。口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病,该病可引起偶蹄类动物的口、足等部位皮肤出现水泡而造成部份动物死亡,严重影响畜牧产业的发展。VP1蛋白是FMDV的主要结构蛋白,是病毒感染细胞的关键,具有与细胞受体结合的位点。口蹄疫VP1蛋白可作为研制口蹄疫基因工程疫苗的首选抗原。本研究以猪种布鲁氏菌S2株为亲本株,利用蔗糖自杀质粒载体,将FMDV的VP1基因表达框部分替代了布鲁氏菌wbo A基因,成功构建了重组口蹄疫病毒VP1基因的布鲁氏菌病活疫苗。使用荧光定量PCR的方法对重组菌的VP1基因的转录情况进行检测,发现VP1基因在宿主菌内有显著的转录变化,说明口蹄疫病毒VP1基因在m RNA水平上表达。将重组菌与原始菌灭活后进行超声破碎,行进Western Blot验证,结果显示,重组菌比原始菌多出一条分子量大小为30k Da左右的条带,与VP1蛋白理论大小一致,证明了口蹄疫病毒VP1在布鲁氏菌体内的表达。本研究初步筛选了布鲁氏菌的启动子,并对其强弱进行验证;初步建立了以猪种布鲁氏菌为载体表达外源基因的方法,为布鲁氏菌基因工程活载体疫苗的进一步研究奠定了基础。

关键词：猪种布鲁氏菌口蹄疫病毒VP1基因启动子筛选绿色荧光蛋白疫苗

泰国葡萄糖酸杆菌基因组分析及启动子的筛选与鉴定

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泰国葡萄糖酸杆菌基因组分析及启动子的筛选与鉴定

作者：刘笑笑河南大学

学位级别：硕士

泰国葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter thailandicus）,亦名弗托式葡萄糖酸杆菌,是葡萄糖酸杆菌属中一个相对较新的物种。该菌中含有大量的脱氢酶系,如葡萄糖脱氢酶、山梨醇脱氢酶、甘油脱氢酶等,这些脱氢酶往往以吡咯喹啉醌（Pyrroloquinol... 详细信息

泰国葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter thailandicus）,亦名弗托式葡萄糖酸杆菌,是葡萄糖酸杆菌属中一个相对较新的物种。该菌中含有大量的脱氢酶系,如葡萄糖脱氢酶、山梨醇脱氢酶、甘油脱氢酶等,这些脱氢酶往往以吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone,PQQ）为辅基,催化相应的底物生成L-山梨糖、二羟基丙酮、2-酮基-L-古龙酸等重要的工业产物。这些酶系的编码基因的转录受启动子调控,筛选活性较强的启动子将为这些脱氢酶系的后期代谢工程改造提供有力的调控元件。本研究通过对泰国葡萄糖酸杆菌基因组深入剖析,获得泰国葡萄糖酸杆菌的基因结构和基础代谢途径;通过基因组关键酶基因分析、系统发育树分析和转录组基因表达水平分析,获得强启动子,通过过表达sldAB基因（编码甘油脱氢酶）提高1,3-二羟基丙酮（1,3-Dihydroxyacetone,DHA）的产量,缩短了甘油发酵的时间,获得了有力的启动子调控元件。具体研究结果如下:（1）通过基因组测序获得了*** HD924的完整基因组结构,组装了基因组染色体以及质粒图谱,并对这些基因进行KEGG、GO、COG蛋白数据库的注释,获得了*** HD924的代谢通路。在基因组注释和预测的代谢途径中证明了*** HD924中存在着大量的脱氢酶系,这些脱氢酶中有些以PQQ为辅基,也有部分以NAD为辅酶,还有一些脱氢酶同时具有两种酶系统的编码基因;此外也证实了*** HD924的TCA循环途径并不完整。（2）通过基因组注释,最终筛选出编码GDHA、GDHB、ADHA、ADHB、ALDHA、ALDHB、MDH、pqq-SDH 8个关键酶的基因的启动子:P、P、P、P、P、P、P、P。通过构建91个基因组的系统发育进化树,得到系统发育进化距离亲近物种*** WSH-003;根据*** WSH-003启动子的研究结果,选择*** HD924基因组中与*** WSH-003的强启动子基因有相同功能的基因dnak、flb,获得了其启动子P、P。通过*** HD924甘油发酵4个时期的RNA转录组测序,选择整个发酵阶段都稳定表达且表达量相对较高的基因预测启动子,最终筛选出cpb、csp、uos三个功能基因的上游启动子:P、P、Puos。（3）以P为强启动子对照,检测了基因转录水平、启动子荧光强度和*** HD924细胞生长密度测评上述13个启动子的活性强度,最终筛选出P为最强启动子。蓝光照射所有启动子重组菌中后期发酵细胞,*** HD924p BBR-P-egfp荧光最亮;荧光定量PCR检测其启动子对报告基因egfp的相对转录水平,结果显示P约是强启动子P（对照）的10.2倍,荧光强度与细胞密度比值P约是强启动子P（对照）的17倍。（4）本研究以荧光定量PCR对重组菌*** HD924 p BBR-P-sldAB过表达sldAB基因的转录水平进行检测,以高效液相色谱检测甘油发酵过程中甘油和DHA的含量。荧光定量PCR实验结果显示:重组菌*** HD924 p BBR-P-sldAB的sldAB基因转录水平是野生型菌株和强启动子P对照重组菌的5.8倍和3.3倍。高效液相色谱结果表明:野生型菌株发酵培养36 h进入生长稳定期,甘油的转化率为36.0%,DHA的产量是21.4 g/L;对照菌株*** HD924 p BBR-P-sldAB发酵培养28 h进入生长稳定期,甘油转化率为46.8%,DHA的产量是38.9 g/L;*** HD924 p BBR-P-sldAB重组菌发酵培养20 h进入生长稳定期,甘油的转化率为73.7%,DHA的产量是70.5 g/L。相比于野生型菌株,*** HD924p BBR-P-sldAB重组菌使得DHA产量提高了2.3倍,而甘油转化时间缩短了44.4%。结果证明,P启动子可以作为*** HD924转化甘油为DHA代谢工程中调控sldAB基因的元件并提高DHA的产量。

关键词：关键酶基因系统发育树转录组启动子筛选 sldAB基因过表达

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芽孢杆菌中新型启动子的克隆与改良研究

芽孢杆菌中新型启动子的克隆与改良研究

作者：柴昊男天津科技大学

学位级别：硕士

芽孢杆菌是革兰氏阳性菌,具有良好的分泌胞外蛋白能力,是蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多种重要工业酶的生产菌株。随着分子生物学和基因工程的迅速发展,芽孢杆菌作为基因表达系统得以不断发展,展现出良好的应用前景。其中启动子元件在芽孢... 详细信息

芽孢杆菌是革兰氏阳性菌,具有良好的分泌胞外蛋白能力,是蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多种重要工业酶的生产菌株。随着分子生物学和基因工程的迅速发展,芽孢杆菌作为基因表达系统得以不断发展,展现出良好的应用前景。其中启动子元件在芽孢杆菌表达系统中发挥着重要作用,现有的芽孢杆菌启动子不足以满足工业上利用芽孢杆菌大量表达外源基因的要求,因此寻找新型的强启动子是非常必要的。本研究旨在克隆新型芽孢杆菌启动子,完善和优化芽孢杆菌表达系统,为工业酶制剂的菌种改良提供一个基础的操作平台,也为将极具应用潜力的芽孢杆菌打造成高效表达体系奠定理论基础和依据。主要研究内容如下:（1）以已报道的多种芽孢杆菌启动子为表达元件,编码克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因Alk为报告基因,构建多种重组蛋白酶表达载体转化枯草芽孢杆菌,对比分析启动子的活性。结果显示,八种启动子的活性存在很大差异,组成型启动子的表达活性明显高于诱导型启动子。其中启动子Pshuttle-09活性最高,碱性蛋白酶酶活可达到345.93 U/mL,P43 启动子次之,酶活为 135.03 U/mL。（2）以碱性蛋白酶基因Alk为报告基因,利用半补齐反应构建地衣芽孢杆菌启动子基因文库的方法构建了芽孢杆菌启动子捕获系统,成功筛选到16个新型启动子,以强启动子P43为对照,启动子P4、P5、P12的表达强度和P43启动子表达活性相差不大,最高可达158.63 U/mL。重组载体表达强度相对不高,转化效率也较低。（3）构建大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体pWHA1520表达碱性蛋白酶,提高转化效率。将根据转录组分析获得的启动子连接到表达载体上,成功构建了 22个重组表达载体,并发现了一对表达强度较高的双向启动子pLA/pLB,pLA的表达活性可达到Pshuttle-09 的 1.43 倍。（4）将（3）中构建好的表达系统用于解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中碱性蛋白酶的表达,实现了碱性蛋白酶的高效表达。解淀粉芽孢杆菌中,P4129、P4130、P3197、P1758和P3035等5个启动子的表达强度明显高于其他17个启动子,P4129表达活性最高,可达到528.45 U/mL,产酶量明显高于枯草芽孢杆菌。地衣芽孢杆菌摇瓶发酵产酶水平达到1.24×104 U/mL,比原始菌株2709提高近40%。

关键词：芽孢杆菌启动子筛选载体构建碱性蛋白酶

黑曲霉高同源重组效率菌株的构建及异源小分子量蛋白monellin的表达研究

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黑曲霉高同源重组效率菌株的构建及异源小分子量蛋白monellin的表...

作者：李科华南理工大学

学位级别：硕士

黑曲霉作为公认的食品安全菌(GRAS菌),具有强大的蛋白分泌能力,能够生产大量的工业酶,它具有清楚的遗传背景,且能在相对廉价的培养基上快速生长,是食品酶和食品级蛋白生产的主要细胞工厂。然而,黑曲霉的遗传操作难,同源重组效率低下,这... 详细信息

黑曲霉作为公认的食品安全菌(GRAS菌),具有强大的蛋白分泌能力,能够生产大量的工业酶,它具有清楚的遗传背景,且能在相对廉价的培养基上快速生长,是食品酶和食品级蛋白生产的主要细胞工厂。然而,黑曲霉的遗传操作难,同源重组效率低下,这极大的增大了对黑曲霉的研究难度。目前提高黑曲霉同源重组效率的方法是敲除非同源末端连接(Non-homologous End Joining,NHEJ)中的关键基因ku70或ku80或ligⅣ,但NHEJ途径缺陷可能会导致黑曲霉宿主菌染色体稳定性、紫外抗性以及生长受到影响。本研究针对黑曲霉NHEJ途径缺陷株的瓶颈问题,参考酿酒酵母高同源重组效率理论基础,强化黑曲霉中同源重组途径中关键基因的表达来提高黑曲霉同源重组的效率。其次,与真菌来源的蛋白产量相比,非真菌来源的异源蛋白在黑曲霉中的表达产量相差约3个数量级,这是目前黑曲霉表达系统的瓶颈问题。来源于西非植物的甜蛋白monellin,因其甜度高和本身不含糖的优势,具有成为食品级甜味剂的前景,但在黑曲霉中建立痕量表达异源蛋白的检测方法非常困难,主要由于表达量极低、自身分子量小、不能检测其蛋白活性,常规的蛋白质电泳手段无法检测到。本研究将基于生物发光的HiBiT-Tag与低表达的monellin融合,建立异源小分子量蛋白在黑曲霉中表达的检测方法。并从增加monellin拷贝数、将monellin与内源高表达的糖化酶glaA融合表达、胞外蛋白酶降解、过表达分子伴侣、减弱ERAD途径、增强细胞生物膜磷脂类合成等方面探索提高monellin表达量的策略。主要研究内容如下:(1)在黑曲霉SH-1WT中过表达AnRad52、mreA、Sae2和酿酒酵母的Rad52基因ScRad52,以黑曲霉内源基因gus作为报告基因,结合CRISPR-HDR技术在aamA和glaA两个位点验证了过表达菌株的同源重组效率。在Cas9切割产生双链断裂时,与对照菌株相比,过表达AnRad52的菌株OEAnRad52在aamA和glaA两个位点的同源重组效率分别提高了 20%和40%;过表达mreA的菌株OEmreA在aamA和glaA两个位点的同源重组效率分别提高了 16%和20%,成功的筛选出了一株具有较高同源重组效率的菌株OEAnRad52。结合SH-1WT的转录组测序,筛选并验证了三个强启动子P1(PglaA)、P2(PaamA)和P7(Pna/TPI)。(2)在黑曲霉菌株SH-2(ΔkusA,ΔpyrG)中,利用基于生物发光的HiBiT标签蛋白融合在密码子优化后的monellin的C末端,选择强启动子P1(PglaA),构建了monellin表达框并敲入glaA位点。结合cDNA的PCR验证、monellin-HiBiT-tag发光检测技术和monellin-HiBiT-tag蛋白印迹实验成功在转化子菌株MH中检测到了 monellin的表达,建立了异源小分子量蛋白monellin在无孢黑曲霉中的痕量表达检测方法。(3)在菌株MH的基础上,我们尝试了几种策略去提高monellin的表达量。第一,增加monellin的拷贝数,相比于MH,三拷贝monellin的表达菌株3MH中monellin的表达量提高了 2.70倍,五拷贝monellin的表达菌株5MH中monellin的表达量增加了4.10倍。第二,将monellin与黑曲霉糖化酶基因glaA融合表达使得monellin的表达量增加了 2.80倍。第三,在菌株MH中敲除胞外蛋白酶pepA和pepB分别使得monellin的表达量提高了 3.70倍和2.35倍。第四,在菌株MH中过表达维持黑曲霉磷脂稳态的关键基因ino2和opi3分别能够使monellin的表达量提高3.67倍和1.90倍。此外,我们探索了过表达分子伴侣、减弱ERAD途径对monellin表达的影响。最后,在monellin的五拷贝表达菌株5MH中同时敲除胞外蛋白酶基因pepA、pepB,获得了最大的monellin表达量,与5MH相比monellin的表达量增加了 13.54倍,与基础菌株MH相比,monellin的表达量增加了 55.51倍。通过培养基优化,在摇瓶上清液中定量得到0.284mg/L 的 monellin。本研究首次将重组monellin在黑曲霉中表达,旨在探索黑曲霉中提高异源蛋白分泌表达的方法,可以为其他异源蛋白的表达提供参考。

关键词：黑曲霉 Rad52 启动子筛选 monellin 异源表达 HiBiT-tag 胞外蛋白酶

假交替单胞菌隐性次级代谢产物挖掘体系的构建

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假交替单胞菌隐性次级代谢产物挖掘体系的构建

作者：马梅娜山东大学

学位级别：硕士

微生物天然产物及其衍生物为心血管疾病、癌症、细菌和病毒感染等疾病的治疗以及农业生产上的杂草、害虫等防治作出了很大贡献。他们的结构、生物活性及作用机制复杂多样,使其在新型药物开发中具有重要地位。近年来,多重耐药细菌的流行... 详细信息

微生物天然产物及其衍生物为心血管疾病、癌症、细菌和病毒感染等疾病的治疗以及农业生产上的杂草、害虫等防治作出了很大贡献。他们的结构、生物活性及作用机制复杂多样,使其在新型药物开发中具有重要地位。近年来,多重耐药细菌的流行,对新型抗生素等药物的研发提出了更高的需求,然而天然产物出新率低,近几十年来被应用于临床的抗生素中仅有少数具有新骨架。海洋中蕴藏着丰富的生物资源,其独特的低温低氧高盐高压环境使海洋微生物通过次级代谢等产生抗逆作用,从而使代谢产物的合成、结构和活性更加新颖。变形杆菌作为海洋中微生物的主要分布类群,能够产生许多具有抗菌、抗病毒、抗生物膜、防污和抗癌活性的天然产物,是活性天然产物的主要来源之一。基因组学和代谢组学分析发现海洋微生物基因组上具有大量隐性次级代谢产物的生物合成基因簇,激活这些隐性合成途径进一步挖掘海洋微生物代谢潜力对于新型天然产物的发现及新药开发具有重要意义。本研究聚焦于海洋变形杆菌金黄色假交替单胞菌Pseudoalteromonas flavipulchra S16中新型活性天然产物的挖掘。对*** S16进行代谢组学和基因组学分析,发现除已知化合物alterochromides的生物合成途径外,基因组上有13个未知天然产物的生物合成基因簇,且大多与已知基因簇的相似度较低,具有合成新型天然产物的潜力。利用ExoCET技术对新颖的沉默基因簇BGC8(40 kb)进行直接克隆和修饰,导入三种异源宿主 *** GB05-MtaA、*** KT2440和*** DSM 7029 中表达,但未检测到新化合物产生。因此,我们通过单交换重组对*** S16基因组上的沉默基因簇进行原位激活,将两种启动子Palt和Pery分别插入BGC8核心基因上游,但仍未产生新的产物。然后我们对菌株S16进行了转录组测序,对内源型强启动子进行了活性分析和筛选,并将其用于沉默基因簇的原位激活。对不同培养时间点的*** S16进行转录组测序,选择33个转录水平位于前3.3%的基因上游的启动子作进一步分析。分别将33个内源启动子亚克隆到自杀载体pR6K-attP-phiC31-fluc上,并整合在荧光素酶报告基因fluc上游。同时通过单交换重组及SacB反向筛选将attB位点整合到菌株S16基因组上已知化合物alterochromides生物合成基因簇的核心区域,在引入attB位点的同时对alterochromides生物合成途径进行了失活,以构建荧光素酶基因定点整合且代谢背景较低的突变菌株。之后将带有不同启动子和fluc基因的质粒转入菌株S16,通过PhiC31整合酶介导attB与attP的位点特异性重组将启动子筛选质粒整合到基因组上。然而,由于PhiC31定点整合系统在菌株S16中效率非常低或不能工作,只获得了含有P7启动子的质粒通过启动子区域的单交换重组整合到基因组上的重组菌株。于是将带有启动子和fluc基因的自杀质粒的pR6K复制子替换为可复制的pBR322复制子并通过接合转移将质粒导入*** S16中,荧光素酶活性测定表明启动子P7、P18、P29和P32具有较高的活性。为了进一步验证内源启动子的有效性,本研究通过单交换重组和SacB反向筛选将P7启动子插入*** S16基因组上7个沉默基因簇的上游,包括4个PKS/NRPS杂合基因簇 BGC1、BGC3A、BGC8、BGC7 和 3 个 NRPS 基因簇 BGC2、BGC3B、BGC9。对发酵粗提物进行HPLC-MS分析发现BGC9被成功激活,产生了多个新化合物,化合物的结构、生物活性和生物合成机制有待进一步研究。本研究利用启动子筛选和基因组编辑,在*** S16中成功建立了隐性次级代谢产物的挖掘体系,为*** S16和其他海洋细菌的活性次级代谢产物挖掘提供了有效的途径。

关键词：天然产物假交替单胞菌异源表达启动子筛选原位激活

茶树菇遗传转化体系构建及木质素分解酶Lac基因家族功能分析

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茶树菇遗传转化体系构建及木质素分解酶Lac基因家族功能分析

作者：崔祥华西南林业大学

学位级别：硕士

本文以食药用真菌茶树菇(Agrocybe aegerita)为研究材料,建立稳定的遗传转化体系,筛选出高效适宜的启动子,构建高效表达的通用载体;通过对茶树菇全基因组测序并进行序列比对,通过PCR扩增得到相应的9种漆酶基因,以PEG介导的原生质体遗传... 详细信息

本文以食药用真菌茶树菇(Agrocybe aegerita)为研究材料,建立稳定的遗传转化体系,筛选出高效适宜的启动子,构建高效表达的通用载体;通过对茶树菇全基因组测序并进行序列比对,通过PCR扩增得到相应的9种漆酶基因,以PEG介导的原生质体遗传转化手段将漆酶片段转入高表达载体得到漆酶高表达转化子;通过q RT-PCR技术测得各转化子漆酶表达量,液体培养得到其粗酶液,采用分光光度法测其酶活以及在不同生理生化条件下的漆酶活性,为茶树菇的营养生理及遗传研究奠定基础。主要研究结果如下:(1)构建了茶树菇的遗传转化体系:以茶树菇原生质体为受体、潮霉素抗性基因(hph)作为筛选标记,以增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)为报告基因,应用PEG介导法构建了茶树菇遗传转化体系。结果表明,150μg/m L潮霉素可以完全抑制茶树菇的生长。30℃下用2%裂解酶液酶解菌丝3 h,原生质体得率最高。通过PEG介导将DNA片段转化入茶树菇原生质体后,获得的转化子经潮霉素筛选、PCR验证和荧光显微镜观察,证明外源基因hph和egfp已成功转入茶树菇中并获得稳定表达。(2)高效表达体系的建立:克隆actin、gpd和Pumgpd不同长度5个启动子片段,替换原有的启动子,对靶标基因的表达量进行分析。依据actin基因启动子构建的载体p Aa-actin-1和p Aa-actin-2获得转化子中,靶标基因表达量为对照3倍以上转化子数量分别为50%和33.33%,最高表达量分别为对照的10.45和6.23倍;携带p Aa-gpd-1、p Aa-gpd-2和p Aa-Pumgpd启动子的载体获得的转化子中,表达量为对照3倍以上的数量分别为0、28.57%和25%,最高表达量分别为对照的2.93、7.75和4.31倍。actin启动子获得高表达转化子得率较gpd和Pumgpd启动子片段高,适用于茶树菇转化体系构建。(3)YSG菌株漆酶基因家族的序列特征及过量表达转化子的酶活性分析:通过基因组注释信息及序列分析,共得到9个漆酶基因。克隆全长后连接到高效表达载体。通过q RT-PCR测定各漆酶转化子的表达量后,分别挑选高效表达转化子,以2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(简称ABTS)、愈创木酚、2,6-二甲氧基苯酚为底物,比较9种漆酶过量表达菌株漆酶活性,以Cu、K、Na、Mn、Ca、Fe、Fe、Mg、Zn为底物,研究9种金属离子对漆酶活性的影响,以2.8、3.3、3.8、4.3、4.8、5.3、5.8不同p H环境探究p H对茶树菇9种漆酶过表达转化子漆酶活性的影响,探究不同浓度漆酶酶活抑制剂EDTA对茶树菇9种漆酶过表达转化子漆酶活性的影响。结果发现,茶树菇内漆酶可能为酸性蛋白酶类,酶促反应的最适底物是ABTS;Cu对漆酶酶活有着促进作用,除K、Zn、Na对个别漆酶基因酶活有着促进作用外,其他金属离子对漆酶酶活均为抑制作用,探讨了不同底物与不同金属离子对漆酶催化反应的影响。(4)漆酶基因家族基因过量表达菌株对基质和生长发育的影响:与野生菌株YSG相比,漆酶基因过表达转化子出菇较早。

关键词：茶树菇过量表达 PEG介导转化启动子筛选漆酶活性

pEGF和p40的乳酸乳球菌组成型优化表达

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pEGF和p40的乳酸乳球菌组成型优化表达

作者：张淑霞华南农业大学

学位级别：硕士

乳酸乳球菌常用于食品发酵,是一种公认的安全微生物,其作为益生菌在肠道免疫和抗病原微生物有重要应用价值。乳酸乳球菌因其具有自身分泌蛋白和蛋白酶少,安全性等特点,所以在表达外源蛋白方面具有优势,这使得乳酸乳球菌被广泛作为外源... 详细信息

乳酸乳球菌常用于食品发酵,是一种公认的安全微生物,其作为益生菌在肠道免疫和抗病原微生物有重要应用价值。乳酸乳球菌因其具有自身分泌蛋白和蛋白酶少,安全性等特点,所以在表达外源蛋白方面具有优势,这使得乳酸乳球菌被广泛作为外源蛋白表达重要的宿主。本研究针对乳酸乳球菌的组成型表达方式进行优化。为了提高组成型表达产量,在本研究中对启动子进行筛选,以获得更高表达强度的启动子。选择了乳酸乳球菌核心基因组丰度最高的4个蛋白的启动子和通过文献找到的3个强启动子。以诱导型质粒p NZ8148为骨架,金黄色葡萄球菌核酸酶基因(nuc)作为报告基因,进行启动子筛选。通过检测表达出的酶活活性筛选出一个最强的启动子P1,并且用P1替换了p NZ8148中的Pnis A启动子构建的重组质粒命名为p NZ8148-P1。一般的质粒是以抗生素作为选择标记,但是抗生素的大量使用会造成抗生素泛滥等安全问题,不利于应用。本研究将对p NZ8148-P1进行优化,采用食品级安全筛选标记,对筛选基因进行替换。nisin是唯一用作食品防腐剂的细菌素,能够确保使用安全性,构建表达nisin的抗性基因nsr的载体p NZ8148-P1:nsr,并对其耐受性进行检测,结果显示,其对nisin具有较高的抗性,在300 IU/m L的浓度下仍然能够生长。之后我们删除了p NZ8148-P1:nsr携带的氯霉素(Cm),构建的以nsr为选择标记的食品级表达载体p P1NR,并进行遗传稳定性检测。结果显示,p P1NR在提供选择压力的条件下能够在120代内稳定遗传,所以认为该质粒可以进行遗传操作。相关研究已经证明p EGF能够促进胃肠道的发育,从而促进了仔猪的早期生长,减缓仔猪早期断奶对肠道的损伤。p40是鼠李糖乳杆菌分泌的可溶性蛋白,被认为具有抗凋亡活性,防止氧化剂引起的上皮屏障损伤等功能。本研究将使用优化的表达载体在乳酸乳球菌宿主中表达p EGF和p40。本文以SP作为分泌蛋白的信号肽分泌蛋白。用接头A(EAAAK)A连接p40和p EGF。构建表达载体p P1NR:p EGF和p P1NR:p EGF-p40。在这两株重组菌的上清液中检测到了蛋白,表明了p EGF和p EGF-p40在重组菌中能够成功分泌表达。用这两株重组菌上清液刺激IPEC-J2细胞,检测其对细胞增殖和基因表达的作用。实验结果表明,重组菌NZ9000/p P1NR:p EGF,NZ9000/p P1NR:p EGF-p40的上清均可促进细胞增殖,而且NZ9000/p P1NR:p EGF-p40刺激的细胞增殖效果更明显。并且表明了重组菌NZ9000/p P1NR:p EGF可促进转运蛋白GLUT2,消化酶SUC和受体GLP2R的表达。但是NZ9000/p P1NR:p EGF-p40并没有达到预期的效果,融合表达的形式可能影响蛋白质活性。

关键词：启动子筛选食品级表达载体 nsr pEGF p40