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芹菜叶面微生物吡哆醛还原酶的研究

广东农业科学 2013年第11期40卷 25-28页

作者：雷亮陶朕徐凡吴媚安徽农业大学茶与食品科技学院安徽合肥230036

植物叶际有着丰富的生物多样性,是一个复杂的微生态系统,叶际表面微生物通过与宿主植物的互作,改善其栖居环境并促进植物生长。从芹菜叶际生态系统中分离得到吡哆醛还原酶(Pyridoxal Reductase,PLR),采用苯肼衍生方法检测其活性并确定PL... 详细信息

植物叶际有着丰富的生物多样性,是一个复杂的微生态系统,叶际表面微生物通过与宿主植物的互作,改善其栖居环境并促进植物生长。从芹菜叶际生态系统中分离得到吡哆醛还原酶(Pyridoxal Reductase,PLR),采用苯肼衍生方法检测其活性并确定PLR的来源,对叶际表面微生物进行分离、计数,确定储藏过程中芹菜叶片表面微生物的变化情况,并对PLR的基本酶学性质进行初步研究。结果表明,PLR主要来源于真菌,在相同菌浓度下,PLR活性的强弱依次为真菌>细菌>放线菌。该酶的最适温度为37℃,最适反应pH值为7.5,并且在NADPH的参与下,其催化活性显著提高。

关键词：芹菜叶际微生物吡哆醛还原酶酶性质

烟草叶际微生物中维生素B_6代谢酶吡哆醛还原酶的研究

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江苏农业科学 2013年第10期41卷 324-326页

作者：陶朕安徽农业大学茶与食品科技学院安徽合肥230036

吡哆醛还原酶(pyridoxal reductase,PLR)是维生素B6代谢关键酶。从烟草-叶际微生物共生系统中提取PLR粗酶后,采用苯肼衍生方法测定PLR活性,鉴定PLR酶的来源,对叶际表面微生物进行分离、计数,并分析对应的活性,对其基本的酶学性质进行初... 详细信息

吡哆醛还原酶(pyridoxal reductase,PLR)是维生素B6代谢关键酶。从烟草-叶际微生物共生系统中提取PLR粗酶后,采用苯肼衍生方法测定PLR活性,鉴定PLR酶的来源,对叶际表面微生物进行分离、计数,并分析对应的活性,对其基本的酶学性质进行初步研究。结果表明:叶际微生物是PLR酶的主要来源,从烟草叶面分离得到了细菌、真菌、放线菌3种微生物;数量上细菌>真菌>放线菌;而同浓度下PLR活性比较,真菌>细菌>放线菌;该酶的最适反应温度为35℃,在pH值7.0时,酶活力最高。

关键词：烟草叶际微生物吡哆醛还原酶活性分析

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植物（芹菜）叶片吡哆醛还原酶来源分析

植物（芹菜）叶片吡哆醛还原酶来源分析

作者：雷亮安徽农业大学

学位级别：硕士

维生素B6（VB6）是一种水溶性维生素，游离型为吡哆醇（Pyridoxine,PN）、吡哆醛（Pyridoxal,PL）和吡哆胺（Pyridoxamine,PM），相应磷酸酯形式为磷酸吡哆醇（Pyridoxine-5’-phosphate,PNP）、磷酸吡哆醛（Pyridoxal-5’-phosphate,PLP）和磷酸吡哆胺（Pyridoxamine-5’-phosphate,PMP）。其中PLP是VB6的主要辅酶形式，具有重要的生理功能，除参与多种氨基酸的代谢反应外，还涉及多种物质的合成和代谢反应。在生物体中，存在两种PLP合成途径，一种是从头合成途径（denovoPathway），另一种是补救合成途径（SalvagePathway），植物和微生物可以从头合成PLP，而动物则需要从外界摄取VB6通过补救途径合成机体所需PLP。其中，吡哆醛还原酶（PyridoxalReductase,PLR）是一种重要的酶，催化还原PL生成PN，维持PL在生物体内的动态平衡，具有重要生理作用。在对植物中VB6代谢酶的研究过程中发现，芹菜叶片需经过一段时间的水浴（37℃,6h）以后，才能检测出PLR的催化活性。本课题以芹菜叶际为研究对象，研究吡哆醛还原酶的来源和基本性质。实验采用采用苯肼衍生方法，在410nm处，检测PL和苯肼生成的有色络合物含量，测定芹菜叶片中吡哆醛还原酶（PyridoxalReductase,PLR）活性，并确定PLR的主要来源，结果显示芹菜叶际的PLR活性主要来源于芹菜叶片表面附着微生物。在无菌操作环境中，对芹菜叶际表面微生物进行分离、计数，确定储藏过程中芹菜叶片表面微生物的变化情况，结果表明：PLR主要来源于真菌，在相同菌浓度下，PLR活性的强弱依次为真菌>细菌>放线菌。结果显示：该酶的最适催化温度为37℃，最适催化pH为7.5。在35℃5℃条件下，该酶显示出较高的活性，高于45℃时，随着温度的升高酶活损失加快;在pH7～8.5范围内酶活力较大，在pH6.5时酶活性降低为最高酶活性的44.68%。以NADPH为供氢体时，PLR有显著的催化活性;而以NADH为氢供体时，PLR没有显示催化活性。

关键词：芹菜叶际微生物吡哆醛还原酶酶性质

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植物（烟草）叶片吡哆醛还原酶的来源分析

植物（烟草）叶片吡哆醛还原酶的来源分析

作者：陶朕安徽农业大学

学位级别：硕士

维生素B(VB)是一类吡啶类化合物的总称。基本类型有吡哆醇(Pyridoxine,PN)、吡哆醛(Pyridoxal,PL)、吡哆胺(Pyridoxamine,PM)，对应的磷酸酯型有磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5′-phosphate,PNP)、磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5-′phosphate,PLP)和磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5′-phosphate,PMP)，其中PLP是其重要的辅酶形式，参与涉及氨基酸代谢的多种反应。已有的研究已经确认真核生物、细菌、植物中普遍存在一条相似的PLP补救途径，来实现VB各化合物之间的相互转换。而吡哆醛还原酶(Pyridoxalreductase,PLR)在生物体内VB各化合物转换代谢过程中起重要作用，它可以催化PL转换生成PN。烟草作为一种模式植物，其体内VB各化合物之间的转换代谢已有研究。在对烟草代谢途径中PLR进行研究时，发现磨碎的烟草溶液体系必须经过35°C水浴后，才能检测出PLR活性。本文通过对烟草叶片PLR的来源、性质的研究，为进一步了解烟草体内VB的转换代谢，以及烟草与其叶面微生物间VB转换代谢的相互影响都有重要意义。本实验通过无菌烟草和有菌烟草在磨碎立即反应、35℃水浴后反应两种条件下，分别测定其溶液体系中PLR酶酶活进行比较分析，确认了烟草叶围微生物是烟草叶片PLR的主要来源。烟草叶围微生物分离后经过菌落观察与镜检分析结果为，细菌中的优势菌属是芽孢杆菌、假单胞菌，真菌中优势菌属是酵母菌，放线菌中优势菌属是链霉菌属。在同浓度下测定真菌、细菌、放线菌中PLR酶酶活，发现其大小关系为：真菌>细菌>放线菌。通过不同叶面环境下测定叶面微生物数量，得到了烟草叶围微生物数量大小关系为：细菌>真菌>放线菌。经过对烟草中PLR粗酶在不同反应时间，不同反应pH以及不同反应温度下酶活的测定，得到了此酶在35℃，在pH7.0，反应2h时酶活力最高。经过多种细胞破碎方式的尝试和分级沉淀后，得到了PLR酶是种非细胞质存在形式的酶。

关键词：烟草叶围微生物吡哆醛还原酶活性分析

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烟草叶片吡哆醛—吡哆醇的转化因子研究

烟草叶片吡哆醛—吡哆醇的转化因子研究

作者：余永慧安徽农业大学

学位级别：硕士

维生素B6(VB6)是一类吡啶类化合物的总称,其基本类型可分为游离型的吡哆醇(Pyridoxin, PN)、吡哆醛(Pyridoxal, PL)和吡哆胺(Pyridoxamine, PM),其相应的磷酸酯形式为磷酸吡哆醇(Pyridine-5'-phosphate, PNP)、磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5'-phosphate, PLP)和磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5'-phosphate, PMP)。其中PLP作为VB6的主要作用形式,参与生物体内氨基酸代谢及多种物质的合成代谢。在生物体内,PLP存在两种合成途径,一种称为从头合成途径(de novo pathway),另一种则称为补救合成途径(salvage pathway),植物和微生物均可从头合成PLP,而动物则需要通过补救途径将外界摄取的VB6合成机体所需的PLP。近年来的研究显示,植物和细菌中普遍存在一条可在VB6各类型间相互转换的类似的PLP补救途径。而在VB6的6种同效化合物的转换代谢中,吡哆醛还原酶(Pyridoxal reductase,PLR)参与PL-PN的转换。本文通过将100μg/ml的PL添加到无菌烟草的培养基中,用无菌水对无菌烟草叶片进行30s的浸提处理,经HPLC分析后发现,浸提液VB6的平均值为40.79±27μg/g鲜叶,是未添加PL的无菌烟叶的17.58倍。定量确定了无菌烟草苗在外源添加PL情况下叶片向外分泌VB6的情况。定性确定无菌烟苗具有向叶表分泌PL的能力,与未添加的无菌烟苗相比,其叶表PL含量增加至20倍,总VB6的含量增至17.6倍。通过对培养时间和培养温度的研究发现,二者对烟草体内PL-PN反应的促进作用不显著。添加有PL的无菌烟草苗经过1d、3d、5d培养后,HPLC法检测后发现烟草体内外源添加的PL呈现一个逐渐下降的趋势,而PN在经过短暂的上升后呈下降趋势。将100μg/ml的PL添加到无菌烟草苗的培养基中后,于25℃培养条件下培养2天后,其PL和PN的含量分别为147.201μg/g鲜叶和0.06μg/g鲜叶。培养至第5天后,二者含量分别为80.90μg/g鲜叶和1.40μg/g鲜叶。PL占总VB6比例由97.10%降至95.29%,PN占总VB6比例由0.40%上升至1.64%。将浓度为100μg/ml的PL添加于无菌烟草苗培养基中后,于35℃培养5天后,烟草叶片组织中的PL占总VB6的比例由第2天的95.14%升到95.72%,PN则由0.97%上升至1.10%。添加PL的无菌烟苗培养2天后,相比35℃生长的无菌烟苗,生长于25℃培养条件下的无菌烟草苗的叶片组织中PL含量高6.89μg/g鲜叶。添加PL的无菌烟苗培养5天后,分别于25℃、35℃培养无菌烟苗,PL和PN的含量却相差无几。通过对烟草叶片组织内PL-PN的原因的探究,明确叶表附着的微生物与烟草组织内VB6的代谢关系。在对烟草VB6代谢酶吡哆醛还原酶的研究,确定无菌烟草叶片组织内外源添加PL在有菌环境下,分别经过6h、12h、24h的35℃C水浴加热后,在大量增殖的微生物的作用下,烟草叶片组织内外源添加的PL转化为PN,其转化率随着时间的延伸而增高。本论文确认在35℃的水浴加热,微生物大量繁殖的情况下,添加于无菌烟草的PL大量转化为PN,并且,PN的转化率随着加热时间的延长而增高。通过在烟草体内VB6提取液中添加Vc及NAPDH的实验,发现PL与PN的相对占比并未发生改变,由此推断,PL-PN是一个酶促反应。供氢体NAPDH及抗氧化剂Vc不会导致PL-PN的发生。

关键词：无菌烟草苗叶表微生物吡哆醛还原酶吡哆醛吡哆醇

茶树维生素B6代谢酶基因PLK、PNPO和PLR的克隆与表达

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茶树维生素B6代谢酶基因PLK、PNPO和PLR的克隆与表达

作者：夏莹安徽农业大学

学位级别：硕士

维生素B(Vitamin B,VB)是一组可相互转化的2-甲基-3-羟基吡啶类化合物的总称,包括吡哆醇(Pyridoxine,PN)、吡哆醛(Pyridoxal,PL)、吡哆胺(Pyridoxamine,PM)及三者分别对应的磷酸酯形式:磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5’-phosphate,PNP)、磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate,PLP)和磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5’-phosphate,PMP)。其中,PLP是VB中发挥活性作用的最主要形式,它是140多种细胞酶的辅酶,参与生物体内多种物质的合成与代谢。植物可以通过DXP非依赖途径合成PLP,PLP在植物体内经过一系列酶的催化作用代谢转换成不同形式的VB。在这个过程中VB磷酸酶、PL还原酶(PLR,Pyridoxal reductase)、PL激酶(PLK,Pyridoxal kinase)和PNP氧化酶(PNPO,Pyridoxine 5’-phosphate oxidase)起着至关重要的作用。目前在拟南芥中已经成功克隆鉴定出PLK、PNPO和PLR,并通过T-DNA插入突变在基因表达水平上探究了VB其他合成代谢转换酶基因表达的影响,也探索了这些基因对低温、高光、干旱、施加外源激素等胁迫的响应。VB的相关研究材料主要是拟南芥、烟草等草本植物。本实验采用茶树为材料进行PLK、PNPO和PLR相关研究,对植物体内营养素VB的合成和代谢转换具有参考作用。本研究利用拟南芥PLK、PNPO和PLR的编码序列(CDS)在茶树CDS库中比对,寻找到预测编码茶树CsPLK、CsPNPO和CsPLR的CDS,设计引物对CsPLK、CsPNPO和CsPLR的编码框进行克隆得到预期大小的DNA片段,产物测序结果显示CsPLK编码的蛋白质含有344个氨基酸残基,分子量37.9kDa,理论等电点6.21;CsPNPO编码的蛋白质含501个氨基酸残基,分子量48.5kDa,理论等电点5.82;CsPLR编码的蛋白质含有324个氨基酸残基,分子量36.1kDa,理论等电点9.10。在茶树各组织中CsPLK表达量由高到低依次为叶>茎=根;CsPNPO表达量依次为叶>茎>根;CsPLR同样是叶>茎>根。将克隆得到的CsPLK、CsPNPO和CsPLR的编码框CDS导入到pET22b表达载体后在大肠杆菌Rosetta中表达。催化功能验证发现,相对于底物PL,pro--CsPLK的酶活力4.853μmolPLP/mg/min是对照组pro-22b酶活力0.529μmolPLP/mg/min的9.17倍。相对于底物PMP,pro-CsPNPO酶活力4.375μmolPLP/mg/min是对照pro-22b酶活力0.344μmolPLP/mg/min的12.72倍。结果证实了克隆得到的序列编码的蛋白为茶树CsPLK和CsPNPO。以长势一致的一年生龙井43号茶树为材料设置低温和干旱逆境,通过实时荧光定量PCR(QRT-PCR)检测显示低温处理下CsPLK表达先上升,在处理8小时时到达顶点后逐渐下调;CsPNPO表达量则逐渐降低,24 h降到最低,随后有所回升;CsPLR的表达量也随处理时间的延长逐渐下调,在24小时到达最低点,前期下调不明显,后有所恢复但仍低于处理前水平。干旱处理下CsPLK表达量下降,第12天降到最低点,复水后第6天有所回升;CsPNPO在干旱处理后下调,第12天到达最低点,复水后上调;CsPLR的表达则随处理时间的增加而上升,在第12天达到最高,复水6天后下调。结果初步证实了CsPLK、CsPNPO、CsPLR参与茶树对低温和干旱胁迫的响应。

关键词：茶树吡哆醛激酶磷酸吡哆醇氧化酶吡哆醛还原酶维生素B6代谢转换逆境处理