烟草叶片吡哆醛—吡哆醇的转化因子研究

作     者：余永慧 

作者单位：安徽农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄龙全

授予年度：2015年

学科分类：0710[理学-生物学] 071001[理学-植物学] 07[理学] 

主      题：无菌烟草苗 叶表微生物 吡哆醛还原酶 吡哆醛 吡哆醇 

摘      要：维生素B6(VB6)是一类吡啶类化合物的总称,其基本类型可分为游离型的吡哆醇(Pyridoxin, PN)、吡哆醛(Pyridoxal, PL)和吡哆胺(Pyridoxamine, PM),其相应的磷酸酯形式为磷酸吡哆醇(Pyridine-5 -phosphate, PNP)、磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5 -phosphate, PLP)和磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5 -phosphate, PMP)。其中PLP作为VB6的主要作用形式,参与生物体内氨基酸代谢及多种物质的合成代谢。在生物体内,PLP存在两种合成途径,一种称为从头合成途径(de novo pathway),另一种则称为补救合成途径(salvage pathway),植物和微生物均可从头合成PLP,而动物则需要通过补救途径将外界摄取的VB6合成机体所需的PLP。近年来的研究显示,植物和细菌中普遍存在一条可在VB6各类型间相互转换的类似的PLP补救途径。而在VB6的6种同效化合物的转换代谢中,吡哆醛还原酶(Pyridoxal reductase,PLR)参与PL-PN的转换。本文通过将100μg/ml的PL添加到无菌烟草的培养基中,用无菌水对无菌烟草叶片进行30s的浸提处理,经HPLC分析后发现,浸提液VB6的平均值为40.79±27μg/g鲜叶,是未添加PL的无菌烟叶的17.58倍。定量确定了无菌烟草苗在外源添加PL情况下叶片向外分泌VB6的情况。定性确定无菌烟苗具有向叶表分泌PL的能力,与未添加的无菌烟苗相比,其叶表PL含量增加至20倍,总VB6的含量增至17.6倍。通过对培养时间和培养温度的研究发现,二者对烟草体内PL-PN反应的促进作用不显著。添加有PL的无菌烟草苗经过1d、3d、5d培养后,HPLC法检测后发现烟草体内外源添加的PL呈现一个逐渐下降的趋势,而PN在经过短暂的上升后呈下降趋势。将100μg/ml的PL添加到无菌烟草苗的培养基中后,于25℃培养条件下培养2天后,其PL和PN的含量分别为147.201μg/g鲜叶和0.06μg/g鲜叶。培养至第5天后,二者含量分别为80.90μg/g鲜叶和1.40μg/g鲜叶。PL占总VB6比例由97.10%降至95.29%,PN占总VB6比例由0.40%上升至1.64%。将浓度为100μg/ml的PL添加于无菌烟草苗培养基中后,于35℃培养5天后,烟草叶片组织中的PL占总VB6的比例由第2天的95.14%升到95.72%,PN则由0.97%上升至1.10%。添加PL的无菌烟苗培养2天后,相比35℃生长的无菌烟苗,生长于25℃培养条件下的无菌烟草苗的叶片组织中PL含量高6.89μg/g鲜叶。添加PL的无菌烟苗培养5天后,分别于25℃、35℃培养无菌烟苗,PL和PN的含量却相差无几。通过对烟草叶片组织内PL-PN的原因的探究,明确叶表附着的微生物与烟草组织内VB6的代谢关系。在对烟草VB6代谢酶吡哆醛还原酶的研究,确定无菌烟草叶片组织内外源添加PL在有菌环境下,分别经过6h、12h、24h的35℃C水浴加热后,在大量增殖的微生物的作用下,烟草叶片组织内外源添加的PL转化为PN,其转化率随着时间的延伸而增高。本论文确认在35℃的水浴加热,微生物大量繁殖的情况下,添加于无菌烟草的PL大量转化为PN,并且,PN的转化率随着加热时间的延长而增高。通过在烟草体内VB6提取液中添加Vc及NAPDH的实验,发现PL与PN的相对占比并未发生改变,由此推断,PL-PN是一个酶促反应。供氢体NAPDH及抗氧化剂Vc不会导致PL-PN的发生。