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GenPharm International公司转获同源重组技术

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生物技术通报 1990年第11期6卷 25-26页

作者：王旭宁

研究者在上个月宣布的结果表明同源重组将成为基因疗法和培育转基因动物的关键技术,培育这种动物的某家公司已经从大学转获同源重组技术.明确地说,GenPharm Inter-national 公司正从犹他研究基金大学和斯坦福大学转获这项技术.在将外源 ... 详细信息

研究者在上个月宣布的结果表明同源重组将成为基因疗法和培育转基因动物的关键技术,培育这种动物的某家公司已经从大学转获同源重组技术.明确地说,GenPharm Inter-national 公司正从犹他研究基金大学和斯坦福大学转获这项技术.在将外源 DNA 结合到染色体特定位置方面,同源重组(即基因定靶)比微注射更有效、更专一.

关键词：同源重组技术转基因动物基因疗法研究基金微注射斯坦福细胞基因组新霉素抗性基因外源 DNA

利用同源重组技术构建Chordin基因载体及其在成纤维细胞中表达量的研究

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中国畜牧杂志 2021年第2期57卷 196-200页

作者：刘开东荣恒贺建宁张梦瑶赵明柳楠青岛农业大学动物科技学院山东青岛266109 青岛市畜牧兽医研究所山东青岛266000 青岛市动物疫病预防控制中心山东青岛266000

本实验旨在利用同源重组技术构建敖汉细毛羊Chordin基因表达载体,将其转染至成纤维细胞中,分析Chordin基因mRNA及蛋白表达量的变化。以40日龄的胎羊为研究对象,采集组织样品,参照Genbank中Chordin基因序列设计一对含有同源臂的引物,通过... 详细信息

本实验旨在利用同源重组技术构建敖汉细毛羊Chordin基因表达载体,将其转染至成纤维细胞中,分析Chordin基因mRNA及蛋白表达量的变化。以40日龄的胎羊为研究对象,采集组织样品,参照Genbank中Chordin基因序列设计一对含有同源臂的引物,通过PCR反应扩增目的基因片段,利用SoSo试剂盒将目的片段连接至表达载体pcDNA3.1上。鉴定后符合标准即可将pcDNA3.1-Chordin重组表达载体转至大肠杆菌(***)DH5α感受态细胞振荡培养。经质粒提取后将重组质粒pcDNA3.1-Chordin转染至成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测Chordin基因在成纤维细胞中表达量的变化。结果表明:普通PCR反应产物经电泳检测后与目的基因大小一致,位于2874处,且条带单一无杂带;表达载体pcDNA3.1酶切效果良好,经电泳检测其大小位于5428 bp处,且条带单一无杂带;连接后经测序鉴定pcDNA3.1-Chordin表达载体无碱基突变,pcDNA3.1-Chordin表达载体构建成功;转染成纤维细胞后,经检测,转染组的mRNA以及蛋白表达量均极显著高于对照组。本实验成功构建了敖汉细毛羊Chordin基因的表达载体,并成功转染成纤维细胞且表达,为进一步对Chordin基因的功能研究奠定了基础。

关键词：敖汉细毛羊同源重组技术成纤维细胞 RT-PCR Western Blot

荷兰Mogen公司及Leiden大学开发植物同源重组技术

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生物技术通报 1989年第11期5卷 21-21页

作者：孙国凤

荷兰的植物风险企业 Mogen 公司(Leiden)正在开发染色体上的期望基因同外来基因替换的同源重组(homologous recombination)技术。动物细胞方面,近年来同源重组技术的研究已开始取得迅速进展,并可望应用于基因治疗等方面(参阅本刊1989年1... 详细信息

荷兰的植物风险企业 Mogen 公司(Leiden)正在开发染色体上的期望基因同外来基因替换的同源重组(homologous recombination)技术。动物细胞方面,近年来同源重组技术的研究已开始取得迅速进展,并可望应用于基因治疗等方面(参阅本刊1989年1月16日号)。在植物上,为了抑制不希望的基因的表达(例如大豆腥味的原因的脂氧合酶等)。

关键词：同源重组技术 Leiden Mogen 基因替换 recombination 豆腥味 homologous 标记基因风险企业脂氧合酶

羊种布鲁氏菌外膜蛋白10抗原性研究及VirB8基因缺失株载体的构建

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羊种布鲁氏菌外膜蛋白10抗原性研究及VirB8基因缺失株载体的构建

作者：王建玲青海大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌病(简称“布病”)是由布鲁氏菌侵入机体引起人畜发病的乙类传染病,动物感染后表现为雌性流产、雄性睾丸炎等,人类主要通过接触患病动物及动物制品感染布鲁氏菌,感染后主要表现为间歇性发烧、多汗、关节疼痛、睾丸炎等症状,使劳... 详细信息

布鲁氏菌病(简称“布病”)是由布鲁氏菌侵入机体引起人畜发病的乙类传染病,动物感染后表现为雌性流产、雄性睾丸炎等,人类主要通过接触患病动物及动物制品感染布鲁氏菌,感染后主要表现为间歇性发烧、多汗、关节疼痛、睾丸炎等症状,使劳动能力不同程度的减弱。为布鲁氏菌疫苗的研制提供理论基础,本研究从布鲁氏菌病患者全血中分离布鲁氏菌并以该菌为模板,克隆Omp10蛋白基因,构建原核表达载体和真核表达载体,来研究Omp10蛋白的相关功能;同时以该菌为模板,通过CRISPR-Cas9方法和同源重组方法构建羊种布鲁氏菌的VirB8基因缺失株,来研究VirB8基因的缺失对布鲁氏菌的影响。实验结果表明:1、通过血清学、病原学及分子生物学实验,在布鲁氏菌病患者全血中分离出了布鲁氏菌并鉴定该菌为羊种3型。2、以分离的羊种3型布鲁氏菌为模板,克隆Omp10蛋白基因,构建原核表达载体(Omps-p ET28a)和真核表达载体(PCDNA3.1-Omp10),通过免疫荧光实验、淋巴细胞增殖实验、CCK8实验、流式细胞术等实验证明了Omp10蛋白同时具备抗原性和免疫原性。3、运用pBBR1 MCS-5质粒和Pwt Cas9-Bacteria质粒,以及人工合成的trc启动子和sgRNA Scaffold片段,通过酶切和酶连技术,构建可以在布鲁氏菌中表达Cas9蛋白的pCas9-PBBR1-sgRNA工作质粒。4、构建同源重组质粒T19-VirB8-LR,将pCas9-PBBR1-sgRNA工作质粒和同源重组质粒共同转化至布鲁氏菌感受态细胞中。筛选阳性菌落,进行PCR鉴定,结果未得到VirB8基因缺失株。CRISPR-Cas9系统在布鲁氏菌基因编辑中的应用有待进一步研究。

关键词：羊种布鲁氏菌外膜蛋白10 CRISPR-Cas9 同源重组技术

抗CD147全人源IgG1抗体的研制及生物特性的鉴定

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抗CD147全人源IgG1抗体的研制及生物特性的鉴定

作者：刘妍南方医科大学

学位级别：硕士

背景:CD147(cluster of differentiation 147)是一个跨膜糖蛋白,高表达于多种肿瘤细胞,多项研究证实其参与多种疾病的发生发展,我们实验室前期研究也发现敲低CD147的表达可显著增强曲妥珠单抗对HER2阳性乳腺癌敏感细胞的抑制作用,提示CD... 详细信息

背景:CD147(cluster of differentiation 147)是一个跨膜糖蛋白,高表达于多种肿瘤细胞,多项研究证实其参与多种疾病的发生发展,我们实验室前期研究也发现敲低CD147的表达可显著增强曲妥珠单抗对HER2阳性乳腺癌敏感细胞的抑制作用,提示CD147是一个有价值的治疗肿瘤及自身免疫性疾病的靶点。目前,已有针对CD147的鼠单抗用于肝癌的靶向治疗。人源抗体在体内治疗应用中比鼠单抗更具优越性,尚未见相关报道。目的:运用实验室构建的噬菌体抗体库筛选平台筛选特异性人源抗CD147单链抗体(scFv),利用同源重组技术将scFv转换为人源抗CD147IgG1抗体,并鉴定其生物特性,为后续评价其生物功能奠定基础。方法:通过酸洗脱法从噬菌体抗体库筛选抗CD147-scFv,用常规ELISA、DNA测序、细胞ELISA和竞争抑制实验鉴定其特异性;用硫氰酸按洗脱法对其相对亲和力进行初步测定:以scFv为模板扩增scFv轻重链可变区,通过同源重组技术构建全人源抗CD147 IgG1真核表达载体并在293F真核细胞获得表达;用亲和层析法分离纯化抗体,SDS-PAGE鉴定纯化效果;用ELISA和Western Blot验证抗体的特异性;用CCK-8法初步测定抗体对表达CD147乳腺癌细胞增殖能力的影响。结果:1、通过四轮富集性筛选,抗体获得750倍富集;经常规ELISA、DNA序列分析、细胞ELISA和竞争抑制实验鉴定,获得了 3个具有不同基因型序列的特异性克隆(13号、15号和168号),其轻重链的可变区分属VλI/VH Ⅰ、VκⅢ/VHⅢ、和VλⅢ/VHⅢ亚群;成功进行可溶性表达后证实三者均可与CD147特异结合。用硫氰酸铵洗脱法测出3个抗CD147-scFvs的相对亲和指数(RAI)分别为0.2 mol/L、0.35 mol/L和0.6 mol/L,其中,168号的相对亲和力优于13号和15号。2、PCR扩增3种抗CD147-scFv的VH、Vκ/λ序列,琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小正确;采用同源重组技术构建表达载体,琼脂糖凝胶电泳鉴定和DNA测序分析核实,显示成功构建了它们的完整人源IgG1表达载体。3、轻重链表达载体等比例转染HEK293F细胞,无血清培养液培养3天后收集部分上清进行ELISA检测,证实表达了完整人源抗体;继续培养至第7天,收集细胞上清,采用亲和层析法进行抗体分离纯化,SDS-PAGE鉴定纯化后抗体纯度可达95%;经过ELISA和Western Blot两种方法鉴定特异性,结果显示抗体能与CD147特异结合。4、采用CCK-8法测定结合活性较好的168号抗体对乳腺癌细胞增殖的影响,结果显示其对乳腺癌细胞的增殖有一定的抑制作用。结论:从噬菌体抗体库筛选出了抗CD147的特异性人源scFv,证实其特异性后在真核细胞成功表达出人源抗CD147 IgG1,并证实其对乳腺癌细胞的增殖有一定抑制作用。

关键词： CD147 噬菌体抗体库单链抗体同源重组技术全人源IgG1

从甘油途径生物法合成P3HP和1,3-PDO

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从甘油途径生物法合成P3HP和1,3-PDO

作者：杨鹏大连工业大学

学位级别：硕士

石油基材料的产生给人类的生活带来了极大的便利,但随着人类对石油基材料的需求越来越大,其无法被环境降解的缺点也带来了严重的环境问题,同时,随着全球石油储量的下降,寻找一种能替代现行塑料性能,又不造成白色污染的塑料替代品——可... 详细信息

石油基材料的产生给人类的生活带来了极大的便利,但随着人类对石油基材料的需求越来越大,其无法被环境降解的缺点也带来了严重的环境问题,同时,随着全球石油储量的下降,寻找一种能替代现行塑料性能,又不造成白色污染的塑料替代品——可降解塑料成为当前的研究热点。聚3-羟基丙酸(P3HP)作为PHA家族中的一员,因其具有特殊的物理、化学性能而成为当前可降解塑料研究中的热点。本文利用基因重组技术,在大肠杆菌中构建了一套以甘油为底物合成P3HP的代谢途径,通过发酵生产成功的获得了P3HP。主要结果如下：(1)以甘油为底物合成P3HP。甘油脱水酶是控制甘油分解和产生P3HP的关键性限速酶,对P3HP的转化速率起着至关重要的作用。本文对甘油途径进行了改进,通过在大肠杆菌中引入肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶基因dhaB123及其辅助因子基因gdrAB代替丁酸梭菌的甘油脱水酶,使得整个代谢反应过程可以在有氧的条件下进行。单因素优化得到最适培养条件,最终得到了1.54 g/L的P3HP,占细胞干重的50%。(2)以甘油为底物发酵生产P3HP和1,3-丙二醇。以甘油为底物生物合成3-HP的代谢途径中,存在还原力不平衡的问题,限制了P3HP的产量。本文在P3HP的合成途径中引入1,3-PDO的合成,以平衡细菌体内还原力。通过自杀性载体系统介导的同源重组技术,将甘油脱水酶及其激活因子的合成基因整合到大肠杆菌基因组中,能够有效的降低质粒的丢失率,保持质粒稳定性。经过发酵条件优化后,最终构建的工程菌可以获得2.7 g/L的P3HP和2.4 g/L的1,3-PDO,相比此前研究中1.54 g/L的P3HP摇瓶产量,此代谢途径P3HP产量有了近两倍的提高,且同时能够获得1,3-PDO。

关键词：聚3-羟基丙酸甘油脱水酶大肠杆菌还原力同源重组技术质粒稳定性

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DDX6突变体的构建

浙江中西医结合杂志 2019年第4期29卷 273-276,I0002页

作者：周焱琳唐翠兰于秀芝浙江中医药大学第二临床医学院内科学杭州310000 浙江大学医学院附属第二医院全科医学杭州310000 河南省驻马店市中心医院肛肠科河南463000

目的构建人源性DDX6多种突变体真核表达载体。方法以DDX6-WT为模板,利用同源重组技术构分别建出2个突变体,根据突变位置,分别命名为DDX6-EQ、DDX6-△C。结果经PCR、酶切、测序和Western Blot鉴定,构建出无解旋酶活性的DDX6-EQ和无ATP酶... 详细信息

目的构建人源性DDX6多种突变体真核表达载体。方法以DDX6-WT为模板,利用同源重组技术构分别建出2个突变体,根据突变位置,分别命名为DDX6-EQ、DDX6-△C。结果经PCR、酶切、测序和Western Blot鉴定,构建出无解旋酶活性的DDX6-EQ和无ATP酶、解旋酶活性的DDX6-△C,蛋白分子量分别为54kD,34kD。结论成功构建2个突变体,为进一步研究DDX6在癌症进展过程中的调控作用奠定基础。

关键词： DDX6 质粒构建同源重组技术

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转基因猪在农业和生物医学中的应用

国外畜牧学（猪与禽） 2003年第5期23卷 38-41页

作者： R.S.Prather 项智锋张德福美国密苏里-哥伦比亚大学动物科学系

早期方法制备转基因猪仅局限于外源基因的随机整合。胎儿体细胞同源重组技术与核移植技术相结合 ,使猪的基因组定位修饰成为可能。在人猪器官移植研究中 ,对引起超急排斥反应(HAR)基因进行敲除 ,首次实现了猪基因组的定位修饰。因为猪... 详细信息

早期方法制备转基因猪仅局限于外源基因的随机整合。胎儿体细胞同源重组技术与核移植技术相结合 ,使猪的基因组定位修饰成为可能。在人猪器官移植研究中 ,对引起超急排斥反应(HAR)基因进行敲除 ,首次实现了猪基因组的定位修饰。因为猪被广泛用作人类疾病模型 ,所以基因修饰为改变这些模型或创建更多模型提供了较好的途径。然而核移植动物易出现表型异常。表型异常可能是外源基因改变而未被正常转入所致。虽然利用核移植基因定位修饰技术已成功制备出转基因动物 ,但核移植技术。

关键词：转基因猪农业生物医学应用外源基因随机整合胎儿体细胞同源重组技术核移植技术

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2015最具潜力的十大新兴科技

宁波经济（财经视点） 2015年第7期 35-37,61页

作者：汪亚楠

前不久,一个由18位科学家组成的专家团队——世界经济论坛新兴技术跨界理事会评选出2015年十大最具潜力的重要技术成果,旨在帮助人们了解未来技术趋势,消除人们对新技术的疑虑与担忧,并弥补阻碍技术发展的投资、监管以及公众认知之间的... 详细信息

前不久,一个由18位科学家组成的专家团队——世界经济论坛新兴技术跨界理事会评选出2015年十大最具潜力的重要技术成果,旨在帮助人们了解未来技术趋势,消除人们对新技术的疑虑与担忧,并弥补阻碍技术发展的投资、监管以及公众认知之间的鸿沟。从无人机到AI兴起,这个榜单让我们一睹快速迈向未来的科技。

关键词：公众认知新兴技术燃料电池热固性塑料未来技术新兴科技专家团队技术发展转基因动植物同源重组技术