利用同源重组技术构建Chordin基因载体及其在成纤维细胞中表达量的研究

作     者：刘开东 荣恒 贺建宁 张梦瑶 赵明 柳楠 

作者机构：青岛农业大学动物科技学院山东青岛266109 青岛市畜牧兽医研究所山东青岛266000 青岛市动物疫病预防控制中心山东青岛266000 

出 版 物：《中国畜牧杂志》 (Chinese Journal of Animal Science)

年 卷 期：2021年第57卷第2期

页      面：196-200页

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 090501[农学-动物遗传育种与繁殖] 

基　　金：国家绒毛用羊产业技术体系(CARS-39-05) 

主　　题：敖汉细毛羊 同源重组技术 成纤维细胞 RT-PCR Western Blot 

摘      要：本实验旨在利用同源重组技术构建敖汉细毛羊Chordin基因表达载体,将其转染至成纤维细胞中,分析Chordin基因mRNA及蛋白表达量的变化。以40日龄的胎羊为研究对象,采集组织样品,参照Genbank中Chordin基因序列设计一对含有同源臂的引物,通过PCR反应扩增目的基因片段,利用SoSo试剂盒将目的片段连接至表达载体pcDNA3.1上。鉴定后符合标准即可将pcDNA3.1-Chordin重组表达载体转至大肠杆菌(***)DH5α感受态细胞振荡培养。经质粒提取后将重组质粒pcDNA3.1-Chordin转染至成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测Chordin基因在成纤维细胞中表达量的变化。结果表明:普通PCR反应产物经电泳检测后与目的基因大小一致,位于2874处,且条带单一无杂带;表达载体pcDNA3.1酶切效果良好,经电泳检测其大小位于5428 bp处,且条带单一无杂带;连接后经测序鉴定pcDNA3.1-Chordin表达载体无碱基突变,pcDNA3.1-Chordin表达载体构建成功;转染成纤维细胞后,经检测,转染组的mRNA以及蛋白表达量均极显著高于对照组。本实验成功构建了敖汉细毛羊Chordin基因的表达载体,并成功转染成纤维细胞且表达,为进一步对Chordin基因的功能研究奠定了基础。