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利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒

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郧阳医学院学报 2006年第1期25卷 1-5,F0002页

作者：姚玲玲王家宁黄永章郭凌郧郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所湖北十堰442000

目的:利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒,为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础。方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长... 详细信息

目的:利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒,为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础。方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDNA。将扩增的CAT cDNA与dATP反应,利用Taq DNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CAT cDNA的3′末端加"A"并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CAT cDNA插入至中间载体pGEM-T Easy Vector中,经PCR、限制性酶切分析鉴定重组子pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1,然后酶切鉴定。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经SalⅠ-BglⅡ和XhoⅠ-BamHⅠ双酶切,利用同尾酶(SalⅠ与XhoⅠ,BglⅡ与BamHⅠ)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CAT cDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。结果:获得pET15b-PEP-1-CAT重组子,经测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CAT cDNA序列一致。结论:pET15b-PEP-1-CAT的成功构建为产生融合蛋白H is tag-PEP-1-CAT进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定了基础。

关键词：同尾酶过氧化氢酶 TA克隆 DNA重组 PEP-1肽

基于同尾酶技术构建CCL3L1基因串联重组质粒的方法

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现代生物医学进展 2012年第2期12卷 239-241,234页

作者：乔录新张世杰石英陈德喜首都医科大学附属北京佑安医院感染科北京100069 首都医科大学附属北京佑安医院病理科北京100069

目的:利用同尾酶技术将CCL3L1基因重复连续插入pcDNA6.2-GW/miR载体,构建含有CCL3L1基因串联体的重组质粒,实现小片段CCL3L1有效延长。方法:PCR扩增CCL3L1基因并在引物的两端设有同尾酶BamHI和BglII限制性内切酶位点,纯化PCR产物插入pMD... 详细信息

目的:利用同尾酶技术将CCL3L1基因重复连续插入pcDNA6.2-GW/miR载体,构建含有CCL3L1基因串联体的重组质粒,实现小片段CCL3L1有效延长。方法:PCR扩增CCL3L1基因并在引物的两端设有同尾酶BamHI和BglII限制性内切酶位点,纯化PCR产物插入pMD18-T载体,阳性克隆命名为pMD18T-CCL3L1。BamHI和BglII双酶切pMD18T-CCL3L1和pcDNA6.2-GW/miR载体后将第一个CCL3L1片段插入pcDNA6.2-GW/miR载体命名为pcDNA6.2-CCL3L1-1。由于载体本身在BglII位点后带有XhoI酶切位点利用BamHI和XhoI切割pcDNA6.2-CCL3L1-1回收CCL3L1片段,BglII和XhoI切割pcDNA6.2-CCL3L1-1回收大片段做载体重组形成含有两个连续CCL3L1片段的质粒命名为pcDNA6.2-CCL3L1-2,重复此步骤可得到含有N个CCL3L1基因串联体的重组质粒pcDNA6.2-CCL3L1-X。结果:经酶切和测序证实成功构建含有4个CCL3L1基因串联体的重组质粒pcDNA6.2-CCL3L1-4,并同时产生含有1个和2个CCL3L1基因串联体的重组质粒。结论:利用同尾酶技术可以快速有效地构建CCL3L1基因串联重组质粒,实现目的片段的无限扩大,为小片段基因表达的研究奠定基础。

关键词：同尾酶 CCL3L1 基因串联

新型酵母蛋白表位标记和基因敲除质粒系统的构建及可行性验证

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微生物学报 2019年第5期59卷 939-949页

作者：唐仕伟李辉崔时媛张正坦谢志平上海交通大学生命科学技术学院上海200240

【目的】构建一套用于酿酒酵母基因功能研究的质粒。该套质粒结合pUG系列和pFA6a系列的优点,同时采用同尾酶实现蛋白表位标签的串联插入。【方法】利用PCR技术分别克隆pUG系列质粒的lox P位点、pFA6a质粒多酶切位点和ADH1终止子模块;通... 详细信息

【目的】构建一套用于酿酒酵母基因功能研究的质粒。该套质粒结合pUG系列和pFA6a系列的优点,同时采用同尾酶实现蛋白表位标签的串联插入。【方法】利用PCR技术分别克隆pUG系列质粒的lox P位点、pFA6a质粒多酶切位点和ADH1终止子模块;通过重组连接各片段,构建pCLHN-TRP和pCLHN-URA质粒。在此基础上利用同尾酶实现多种蛋白表位标签的单个或串联重复插入,获得一系列蛋白表位标记质粒。最后,以ATG1、COX4和NHX1为例验证本质粒系列的性能。【结果】在本项工作中,我们共构建2种基因敲除用质粒和17种表位标记用质粒(涵盖1-8 FLAG、1-12 V5、3-9 HA、2-8MYC、GFP和m Cherry)。在几个靶基因上的应用证实了本套质粒的实用性。尤其值得指出的是,通过组合采用不同重复度的串联表位标签,在同一张膜上同时检测表达差异极大的不同蛋白而不使高表达蛋白信号饱和成为可能。【结论】本文所构建的pCLHN质粒系列是对现有酵母质粒工具的有益补充。

关键词：酵母细胞基因敲除蛋白标签同尾酶表达量

pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达与纯化

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南方医科大学学报 2006年第9期26卷 1319-1325页

作者：姚玲玲王家宁黄永章郭凌郧郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所湖北十堰442000

目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带SalI和BglII酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDN... 详细信息

目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带SalI和BglII酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDNA。将扩增的CATcDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CATcDNA的3'末端加“A”并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CATcDNA插入至中间载体pGEM-TEasyVector中得到pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入NdeI和XhoI酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经SalI-BglII和XhoI-BamHI双酶切,利用同尾酶(SalI与XhoI,BglII与BamHI)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的pET15b-PEP-1-CAT重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导目的蛋白表达。然后利用重组蛋白N端的组氨酸“标签”(His-tag)对其进行金属螯合亲和层析纯化。结果测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CATcDNA序列一致。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,pET15b-PEP-1-CAT在***中获得可溶性高表达,经Ni2+-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.15U/g。结论成功构建了原核表达载体pET15b-PEP-1-CAT,并经表达、纯化得到可以天然活性形式穿透细胞的重组过氧化氢酶蛋白,从而为防治心肌缺血再灌注损伤等与氧化应激有关的疾病奠定了基础。

关键词：原核表达过氧化氢酶 TA克隆同尾酶融合蛋白

羊抑制素α亚基N端1-33序列肽段多聚体的构建及其表达纯化

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生物工程学报 2005年第2期21卷 311-314页

作者：黄运茂施振旦于迎春邵西兵华南农业大学动物科学学院广州510642

为了提高短肽的免疫原性以制备短肽基因工程疫苗 ,将羊抑制素α亚基N端 1_33氨基酸残基片段的基因序列插入表达质粒pRSET A的BamHⅠ \SacⅠ位点之间构建重组质粒pR INH ,然后利用质粒中的一对同尾酶位点BamHⅠ \BglⅡ和下游的另一酶切位... 详细信息

为了提高短肽的免疫原性以制备短肽基因工程疫苗 ,将羊抑制素α亚基N端 1_33氨基酸残基片段的基因序列插入表达质粒pRSET A的BamHⅠ \SacⅠ位点之间构建重组质粒pR INH ,然后利用质粒中的一对同尾酶位点BamHⅠ \BglⅡ和下游的另一酶切位点HindⅢ ,经过简单的酶切后 ,将产物按各种组合连接 ,构建了抑制素串联 2至 6聚体基因。含 3至 6聚体基因的重组质粒pR 3INH、pR 4INH、pR 5INH和pR 6INH经IPTG诱导均能在大肠杆菌 (E .coli)BL2 1(DE3)中表达目的蛋白 ,分别占菌体蛋白的 6 %、6 %、7%和 8% ,且都以包涵体形式存在。结果说明 ,利用同尾酶切技术可以快速正确地构建短肽片段的串联多聚体重组质粒 ,为构建短肽半抗原的高免疫原性基因工程疫苗提供了新的思路。

关键词：抑制素同尾酶串联多聚体表达

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疏水性ELP基因设计与基因库构建

微生物学通报 2013年第4期40卷 584-592页

作者：林衡李军明张立超葛高顺许崇波胡学军大连大学生命科学与技术学院辽宁大连116622 大连大学医学院辽宁大连116622

【目的】设计合成疏水性类弹性蛋白(Elastin-like polypeptide,ELP)基因,建立ELP基因库。【方法】选择疏水性最强的异亮氨酸(Ile,I)(疏水参数:4.5)取代ELP五肽重复序列单元(缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-客座氨基酸-甘氨酸,VPGXG)中客座残基X... 详细信息

【目的】设计合成疏水性类弹性蛋白(Elastin-like polypeptide,ELP)基因,建立ELP基因库。【方法】选择疏水性最强的异亮氨酸(Ile,I)(疏水参数:4.5)取代ELP五肽重复序列单元(缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-客座氨基酸-甘氨酸,VPGXG)中客座残基X。全基因合成一段含编码(VPGIG)10序列,上游含DraⅢ酶切位点、下游含BglⅠ酶切位点的ELP单元。将DraⅢ和BglⅠ设计为一对同尾酶(Isocaudarner),利用这对同尾酶定向克隆(Recursive directional ligation,RDL)一系列不同拷贝数的ELP基因。为鉴定基因库有效性,随机选取库中ELP[I]50基因进行蛋白表达、纯化并测定其相变温度(Inverse temperaturetransition,Tt)。【结果】建立了ELP[I]n(n=10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120)基因库。测定ELP[I]50的Tt为24.3°C。【结论】首次单独选用Ile(I)作为ELP蛋白质标签中客座残基氨基酸,增加了ELP中疏水性氨基酸的含量,为进一步筛选出表达量高、Tt低、分子量小的ELP标签奠定基础。

关键词：类弹性蛋白异亮氨酸同尾酶定向克隆

ChIFN-γ基因植物表达载体的构建与瞬时表达

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云南大学学报（自然科学版） 2008年第6期30卷 630-635页

作者：吴拥军赵德刚宋莉许文钊贵州大学生命科学学院贵州贵阳550025 贵州省农业生物工程重点实验室贵州贵阳550025

为了使鸡干扰素-γ(ChIFN-γ)基因在油菜中获得高效表达,优化了油菜偏爱的密码子,在ChIFN-γ的5′端添加Kozark序列,3′端增加内质网滞留信号肽SEKDEL.应用同尾酶将人工合成的ChIFN-γ,Napin特异性启动子及信号肽与NOS终止子克隆到质粒... 详细信息

为了使鸡干扰素-γ(ChIFN-γ)基因在油菜中获得高效表达,优化了油菜偏爱的密码子,在ChIFN-γ的5′端添加Kozark序列,3′端增加内质网滞留信号肽SEKDEL.应用同尾酶将人工合成的ChIFN-γ,Napin特异性启动子及信号肽与NOS终止子克隆到质粒pSH中构建成植物表达载体pSH-NGN.经生菜瞬时表达,ELISA检测表明ChIFN-γ蛋白获得有效表达.研究结果为进一步遗传转化油菜奠定了基础,同时也对构建基因的正确表达提供了一种新的快速鉴定方法.

关键词： ChIFN-γ 同尾酶构建瞬时表达

多靶点CRISPR表达载体系统的设计和构建

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基因组学与应用生物学 2017年第4期36卷 1518-1525页

作者：王令郭苗苗杜伟立杨理凯胡重洋张涛路宏朝陕西理工大学生物科学与工程学院汉中723001

CRISPR/Cas9核酸酶系统能实现多基因的高效靶向编辑,但是多靶点CRISPR表达载体的构建比较复杂。本研究以细菌的DNA旋转酶和二氢叶酸还原酶为靶基因,选择多个打靶位点,合成携带靶序列和多克隆位点的寡聚核苷酸引物,直接退火延伸合成靶序... 详细信息

CRISPR/Cas9核酸酶系统能实现多基因的高效靶向编辑,但是多靶点CRISPR表达载体的构建比较复杂。本研究以细菌的DNA旋转酶和二氢叶酸还原酶为靶基因,选择多个打靶位点,合成携带靶序列和多克隆位点的寡聚核苷酸引物,直接退火延伸合成靶序列DNA,利用同尾酶产生相同粘性末端的特点,将靶序列克隆至骨架载体,然后依次加入更多靶序列,实现多靶点的串联。最后测序验证,单靶点、双靶点和三靶点成功插入CRISPR表达载体,同时保留了多克隆位点,实现多靶点串联。本研究设计的多靶点CRISPR表达载体系统操作简单、成本低、成功率高,为后续细菌多基因编辑提供技术支撑,同时可拓展应用于其他生物多基因打靶研究。

关键词： CRISPR系统多靶点表达载体同尾酶

简易型同源重组载体pAmpR-NeoR的构建和效果检测

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华北农学报 2017年第6期32卷 25-30页

作者：王英泽王巧兰曹晴晴付育刘畅王晨晨杜朝河北科技大学生物科学与工程学院河北石家庄050018

为了构建能够灵活用于CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的供体质粒,利用pcDNA3.1(+)-HA-His为模板,分别扩增了其AmpR-ori片段和NeoR片段,然后连接,构建了一个简易型同源重组载体pAmpR-NeoR。载体的正选择标记NeoR基因两侧分别引入了BamHⅠ和... 详细信息

为了构建能够灵活用于CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的供体质粒,利用pcDNA3.1(+)-HA-His为模板,分别扩增了其AmpR-ori片段和NeoR片段,然后连接,构建了一个简易型同源重组载体pAmpR-NeoR。载体的正选择标记NeoR基因两侧分别引入了BamHⅠ和XhoⅠ作为克隆位点,用于左、右同源臂的克隆。利用这一载体,构建了针对小鼠FasL基因的供体质粒。结果显示靶序列发生基因编辑。pAmpR-NeoR以同尾酶作为多克隆位点,这使其具有良好的扩展性、灵活性和序列通用性,便于根据需要进一步改造,以满足具体试验的不同需求。

关键词：基因编辑同源重组载体同尾酶